用關(guān)鍵蛋白的改變評價微囊藻毒素的毒性效應(yīng).pdf

1、在眾多環(huán)境污染物中，微囊藻毒素(Microcystins，MC)是一種由于人類活動而大量存在的天然污染物，它對人類健康構(gòu)成日益嚴(yán)重的威脅因而越來越引起人們的關(guān)注。MC是藍藻的微囊藻屬、魚腥藻屬、顫藻屬及念珠藻屬的某些品系產(chǎn)生的次生代謝物，藍藻水華的普遍發(fā)生使 MC成為了一種存在廣、影響大的天然毒物。 由于MC的高急性毒性、強促癌活性以及與人類癌癥發(fā)生的相關(guān)性，使其受到研究人員的廣泛重視。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn) MC可以有效地抑制蛋白磷酸酶

2、1(Proteinphosphatase1，PP1)和2A(Protein phosphatase2A，PP2A)的活性，從而對很多細胞內(nèi)過程造成影響，普遍認(rèn)為這種專一性的抑制作用與 MC的強促癌活性有關(guān)。 PP2A主要以核心酶形式在細胞內(nèi)大量存在，它的核心酶由 A結(jié)構(gòu)亞基(PP2A—A)和C催化亞基(PP2Ac)組成。PP2A核心酶可以單獨存在，也可以與B調(diào)節(jié)亞基進一步結(jié)合形成異三聚體形式的全酶。A亞基的結(jié)構(gòu)十分罕見，它由15

3、個前后串聯(lián)的含39個氨基酸序列的HEAT(huntingtin—elonga—tion—Asubunit—TOR，HEAT)基序構(gòu)成。PP2A是參與很多重要細胞功能的主要蛋白磷酸酶之一，它可以調(diào)節(jié)很多種細胞內(nèi)過程，如新陳代謝、轉(zhuǎn)錄、RNA剪接、翻譯、DNA復(fù)制、細胞周期、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞分化以及致癌性轉(zhuǎn)化等。 熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)是不同生物體內(nèi)在氨基酸組成上有著高度同一性的一組蛋白，它們在

4、植物、細菌和動物細胞內(nèi)都有廣泛表達，在多種應(yīng)激性刺激的作用下HSPs的生成會增加，HSP和應(yīng)激相關(guān)已經(jīng)是一個在所有動物種類中可以觀察到的普遍現(xiàn)象。而 HSP70家族是 HSP家族中最為保守和研究最為廣泛的一種。在無應(yīng)激的環(huán)境下它在很多細胞過程中扮演了多種關(guān)鍵的角色；應(yīng)激環(huán)境下，HSP70能對多種物質(zhì)或因素如熱、酒精、氧化損傷、輻射、重金屬、砷、殺蟲劑等作出應(yīng)激性地表達升高反應(yīng)。 雖然對微囊藻毒素毒性及其作用機理的研究已獲得了不少

5、成就，但依然還有許多值得深入探討的問題。本實驗室的蛋白質(zhì)組學(xué)研究提示，微囊藻毒素RR可以引起人羊膜細胞 FL的多種蛋白表達水平改變，其中包括PP2A—A亞基和HSP70。PP2A和 HSP70分別作為微囊藻毒素在細胞內(nèi)主要作用靶點和一種細胞內(nèi)廣泛存在的伴侶蛋白，微囊藻毒素引起其蛋白水平改變是否具有普遍意義?回答這個問題對于進一步探討 MC的早期影響有著重要的意義。本研究采用微囊藻毒素 LR及藍藻粗提物，研究它們對不同生物材料中 PP2A

6、和 HSP70蛋白的影響，研究微囊藻毒素引起兩種蛋白改變的普遍性，為是否有可能將其作為評價微囊藻毒素早期影響的指標(biāo)提供實驗依據(jù)，也為進一步探討 MC的致毒機理提供參考。 根據(jù)實驗設(shè)計，采取動物實驗和細胞實驗相結(jié)合的方法。動物實驗均采用灌胃染毒：將25只 ICR小鼠隨機分成5組，每組5只，即空白對照組和4.65、23.25、46.5、93μg/kg藍藻藻漿劑量。染毒體積均根據(jù)灌胃體積10mL/kg和每只小鼠的體重計算用量，每天一次

7、，共實驗7天，第8天將小鼠稱重后處死，迅速取出所需臟器。細胞實驗方法如下： MC—LR染毒人羊膜細胞 FL，染毒濃度為0、0.05、0.1、0.5、1/μmol·L-1；人肝細胞HL-7702，染毒濃度為0、0.05、0.2、0.5、1μmol·L-1，作用時間24h。染毒結(jié)束后分別提取細胞總蛋白，應(yīng)用Western—Blot法檢測 PP2A—A和HSP70蛋白水平。 主要結(jié)果： 1．不同濃度藍藻藻漿灌胃后，小鼠肝臟 P

8、P2A—A蛋白水平在4.65、23.25、46.5和93 ug/kg劑量組明顯升高，其中23.25和46.5 ug/kg劑量組與對照組相比差異具有顯著性，p＜0.05，93 ug/kg劑量組與對照組相比差異具有顯著性，p＜0.01。小鼠肝組織 HSP70蛋白水平在93 ug/kg劑量組升高，與對照相比差異具有顯著性，p＜0.05。 2．不同濃度藍藻藻漿灌胃后，小鼠腎臟PP2A—A蛋白水平在23.25、46.5和93 ug/kg劑

9、量組明顯升高，其中23.25和93 ug/kg劑量組與對照組相比差異具有顯著性，p＜0.05。而小鼠腎臟組織 HSP70的蛋白水平?jīng)]有明顯的改變。 3．不同濃度藍藻藻漿灌胃后，小鼠腦組織PP2A—A蛋白水平在4.65、23.25、46.5和93 ug/kg劑量組升高，其中4.65和23.25 ug/kg劑量組與對照組相比差異具有顯著性，p＜0.05，46.5和93 ug/kg劑量組與對照組相比差異不具有顯著性，p＞0.05。小鼠

10、腦組織 HSP70蛋白水平在93 ug/kg劑量組升高，與對照相比差異具有顯著性，p＜0.01。 4．不同濃度MC—LR染毒24h后，人羊膜細胞 FL內(nèi) PP2A—A蛋白水平在0.05、0.1、0.5、1umol/L劑量組升高，且與對照組相比差異具有顯著性，p＜0.01。而 FL細胞內(nèi)的 HSP70蛋白水平?jīng)]有明顯改變。 5．不同濃度 MC—LR染毒24h后，HL-7702細胞內(nèi) PP2A—A蛋白水平有下降趨勢，但與對照

11、相比，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義；HSP70蛋白水平呈先上升后下降的趨勢，在0.5umol/L劑量組 HSP70蛋白水平明顯高于對照，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，p＜0.05。 主要結(jié)論： 1．體內(nèi)實驗中藍藻藻漿灌胃染毒能使小鼠肝臟、腎臟和腦組織 PP2A—A亞基蛋白水平改變，體外實驗中 MC—LR染毒能使 FL細胞和HL-7702細胞 PP2A—A亞基蛋白水平發(fā)生改變。PP2A—A亞基蛋白水平的改變有可能是 MCs引起的一種敏感而