從蛋白水平探討微囊藻毒素的毒作用機(jī)制.pdf

1、自上世紀(jì)70年代以來，由于水體富營養(yǎng)化導(dǎo)致世界范圍內(nèi)藍(lán)藻水華頻頻發(fā)生。由藍(lán)藻(主要是銅綠微囊藻)產(chǎn)生的毒素—微囊藻毒素對(duì)人類和家畜都產(chǎn)生了極為嚴(yán)重的影響。微囊藻毒素是一種環(huán)狀七肽類毒素，其中5個(gè)氨基酸為固定成分，一般結(jié)構(gòu)為(D-Ala-L-X-erythro-β-methyl-D-isoAsp-L-Y-Adda-D-isoGlu-N-Methyldehydro-Ala)，其中Adda(3-amino-9-methoxy-2,6,8-tr

2、imethyl-10-phenyldeca-4,6-dienoicacid)是一種特殊的氨基酸，是微囊藻毒素生物活性表達(dá)所必需的基團(tuán)。X，Y為兩種可變氨基酸，由此產(chǎn)生60多種同類物，其中存在較多、毒性較大的是微囊藻毒素-LR和RR，其中L，R分別為亮氨酸，精氨酸，分別縮寫為MC-LR和MC-RR。 同位素示蹤顯示，用氚標(biāo)記的微囊藻毒素進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后，主要分布在肝臟，但發(fā)現(xiàn)腸道和腎臟這兩個(gè)器官內(nèi)也有不同程度的蓄積，提示這三個(gè)臟器是

3、可能都受毒素的影響。而且微囊藻毒素對(duì)很多細(xì)胞都有毒理學(xué)效應(yīng)，包括肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞以及淋巴細(xì)胞等。最近，研究人員首次發(fā)現(xiàn)微囊藻毒素能在無脊椎動(dòng)物(魚、蝦、蟹等)性腺中大量累積，性腺是除肝臟外的第2個(gè)靶器官，微囊藻毒素可在卵中大量存在并傳遞到后代，因此微囊藻毒素對(duì)包括人類在內(nèi)的哺乳動(dòng)物生殖的影響也應(yīng)該受到關(guān)注和重視。同時(shí)微囊藻毒素可以在魚類、蝦、蟹體內(nèi)富集，沿食物鏈出現(xiàn)生物放大現(xiàn)象，進(jìn)而影響整個(gè)水生生態(tài)系統(tǒng)和人

4、類健康。 微囊藻毒素由于它們的高急性毒性、強(qiáng)促癌活性以及與人類癌癥發(fā)生的相關(guān)性而受到全球的關(guān)注。到目前為止，微囊藻毒素所誘導(dǎo)的肝細(xì)胞毒性和強(qiáng)促癌活性的確切機(jī)制尚不明確。微囊藻毒素是一種很強(qiáng)的蛋白磷酸酶1和2A的抑制劑，通過抑制蛋白磷酸酶的活性而導(dǎo)致細(xì)胞蛋白的過度磷酸化，普遍認(rèn)為這與微囊藻毒素的強(qiáng)促癌活性有關(guān)。它也可以解釋微囊藻毒素引起的一些細(xì)胞學(xué)效應(yīng)，如導(dǎo)致細(xì)胞蛋白的過度磷酸化，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞骨架的重組。 近年來許多研究都

5、表明微囊藻毒素能誘導(dǎo)一系列細(xì)胞發(fā)生凋亡，并呈現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)和生化改變，包括細(xì)胞皺縮，染色質(zhì)濃縮，磷酯酰絲氨酸的外露，并進(jìn)而形成凋亡小體，以及DNA的片段化改變。雖然許多研究表明蛋白磷酸化的改變、caspase的激活、以及氧化應(yīng)激和線粒體功能的改變可能在微囊藻毒素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起了很大的作用，但到目前為止，其確切機(jī)制尚不完全明確。 我們實(shí)驗(yàn)室近年來也致力于研究Bcl-2蛋白家族和p53在MC-LR誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的作用

6、。大鼠體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)都說明MC-LR能誘導(dǎo)p53和Bax的表達(dá)，有趣的是，在體外研究中，MC-LR能抑制Bcl-2的表達(dá)，但在體內(nèi)研究中，MC-LR暴露后大鼠肝臟的Bcl-2的表達(dá)沒有明顯的變化。體內(nèi)和體外的毒作用機(jī)理不一致，進(jìn)一步表明微囊藻毒素毒理學(xué)機(jī)制的復(fù)雜性。 目前有很多研究都側(cè)重于分別研究單個(gè)分子與微囊藻毒素誘導(dǎo)的毒性機(jī)制的關(guān)系，如ATP合成酶的β亞基、Bcl-2和p53等都是毒素作用的響應(yīng)蛋白，但是作為一種外來污染物進(jìn)

7、入細(xì)胞后，其對(duì)細(xì)胞內(nèi)功能的影響必然是十分廣泛的，更多的毒素作用后的響應(yīng)蛋白是否存在?為了更好的闡明微囊藻毒素誘導(dǎo)后參與細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)機(jī)制的蛋白，傳統(tǒng)的對(duì)單個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行研究的方式顯然無法滿足高通量篩選毒素作用后響應(yīng)蛋白的要求。以雙向電泳(2-DE)作為分離技術(shù)和質(zhì)譜作為鑒定技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)的方法能同時(shí)分離細(xì)胞內(nèi)幾千個(gè)蛋白，并能研究翻譯后修飾以及蛋白的相互作用，在毒理學(xué)領(lǐng)域受到廣泛的應(yīng)用(Molleretal.，2001)。 因此，在

8、本研究中應(yīng)用PI/AnnexinV-FITC雙染色的方法，借助于流式細(xì)胞儀分析微囊藻毒素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的改變，同時(shí)，應(yīng)用熒光標(biāo)記的caspase-3特異性抑制劑DEVD-FMK研究在此過程中凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3的變化，探討在微囊藻毒素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中caspase-3的作用。應(yīng)用雙向電泳和基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF)相結(jié)合的蛋白質(zhì)組學(xué)方法來篩選微囊藻毒素暴露后的差異表達(dá)蛋白，研究可能存在的差異表達(dá)蛋白與毒

9、素濃度、作用時(shí)間的關(guān)系，找尋對(duì)微囊藻毒素有特異反應(yīng)的蛋白。用Westernblot來分析差異表達(dá)蛋白的改變是否與蛋白質(zhì)組學(xué)得到的結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白質(zhì)組學(xué)研究得到的結(jié)果。通過生物信息學(xué)方法對(duì)差異蛋白進(jìn)行分類，探討不同功能蛋白對(duì)微囊藻毒素的響應(yīng)可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的毒性影響。 主要結(jié)果：1.凋亡關(guān)鍵蛋白caspase-3參與微囊藻毒素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡：微囊藻毒素能誘導(dǎo)腎細(xì)胞凋亡并呈現(xiàn)良好的劑量反應(yīng)關(guān)系。同時(shí)能激活肝、腎這兩種細(xì)胞的ca

10、spase-3，而且兩種細(xì)胞的反應(yīng)性不同，肝細(xì)胞更為敏感。凋亡的發(fā)生與caspase-3的激活有一定的相關(guān)性，說明caspase-3在微囊藻毒素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起了重要的作用。 2.用蛋白質(zhì)組學(xué)方法檢測(cè)到MC-RR作用后細(xì)胞內(nèi)一系列蛋白水平發(fā)生改變：通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析，在量效研究中發(fā)現(xiàn)用不同濃度MC-RR處理后，一共有89個(gè)蛋白點(diǎn)的表達(dá)發(fā)生了改變，其中66個(gè)通過MALDI-TOFMS得到了初步的鑒定。在時(shí)效研究中發(fā)現(xiàn)用1μMMC

11、-RR處理不同時(shí)間后一共有119個(gè)蛋白點(diǎn)的表達(dá)發(fā)生了改變，其中103個(gè)得到了成功鑒定。這些得到成功鑒定的蛋白質(zhì)功能涉及面非常廣，包括與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的蛋白，凋亡相關(guān)蛋白，細(xì)胞骨架蛋白，酶及酶活調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白等，表明微囊藻毒素對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了廣泛而深刻的影響。 3.差異表達(dá)蛋白質(zhì)的Westernblot驗(yàn)證：從成功得到質(zhì)譜鑒定的蛋白質(zhì)中，選擇p53和ERK進(jìn)行westernblot驗(yàn)證。結(jié)果表明westernblot分析得到的結(jié)果與蛋白質(zhì)

12、組學(xué)分析得到的結(jié)果是一致的，說明本實(shí)驗(yàn)中蛋白質(zhì)組分析得到的結(jié)果是可信的。 4.微囊藻毒素不僅能抑制PP2A的活性，而且還能影響其蛋白水平：在時(shí)效研究中發(fā)現(xiàn)微囊藻毒素能改變PP2A調(diào)節(jié)亞基A的蛋白水平。 5.微囊藻毒素作用后既影響其磷酸化水平，又影響其蛋白水平的重要蛋白：本研究中發(fā)現(xiàn)微囊藻毒素能影響ERK、p53和tubulin的蛋白水平，而且已有研究表明這些蛋白的磷酸化水平都受微囊藻毒素的調(diào)節(jié)。 6.本研究中發(fā)現(xiàn)

13、的未見報(bào)道與微囊藻毒素毒作用機(jī)制相關(guān)的蛋白：如真核翻譯起始因子eIF5A、細(xì)胞周期蛋白依賴激酶CDK4、tau蛋白和peroxiredoxin蛋白等，目前為止未見有報(bào)道證明這些蛋白與MC-RR的致毒機(jī)理相關(guān)，為進(jìn)一步研究MC-RR的致毒機(jī)理提供了線索。 主要結(jié)論： 1.Caspase-3可能參與了微囊藻毒素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程，但不是唯一的關(guān)鍵酶，毒素誘導(dǎo)的凋亡中還可能還涉及到其它的蛋白酶，caspase-3是否參與這一過

14、程可能依賴于細(xì)胞類型和毒素作用時(shí)間。 2.用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究微囊藻毒素暴露后細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)的機(jī)制，量效研究中發(fā)現(xiàn)有89個(gè)蛋白的表達(dá)量發(fā)生了改變，而時(shí)效研究中發(fā)現(xiàn)有119個(gè)蛋白的表達(dá)量發(fā)生了改變，說明微囊藻毒素作用后細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了廣泛的變化，有眾多蛋白參與了應(yīng)答反應(yīng)，這些蛋白涉及到細(xì)胞的不同功能。 3.研究發(fā)現(xiàn)僅有極少數(shù)蛋白有劑量依賴關(guān)系和時(shí)間依賴關(guān)系，說明不同濃度微囊藻毒素暴露及暴露不同時(shí)間后細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)機(jī)制是不一樣的，高

15、濃度微囊藻毒素作用后，細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)體系不是低濃度作用后的簡(jiǎn)單放大，存在更為復(fù)雜的致毒機(jī)制，不同濃度微囊藻毒素作用不同時(shí)間后，可能激活細(xì)胞內(nèi)不同的途徑來產(chǎn)生毒性效應(yīng)。 4.微囊藻毒素能抑制PP2A活性這一發(fā)現(xiàn)在毒素毒理機(jī)制研究中是具有里程碑意義的，而本研究中首次發(fā)現(xiàn)微囊藻毒素還能改變PP2A蛋白水平。關(guān)鍵蛋白受到毒素雙重影響的發(fā)現(xiàn)，進(jìn)一步揭示了微囊藻毒素毒作用的嚴(yán)重性和作用機(jī)制的復(fù)雜性。 5.量效研究中用不同濃度的微囊藻毒

16、素作用后p53蛋白水平均上調(diào)，同時(shí)具有劑量依賴關(guān)系，時(shí)效研究中也發(fā)現(xiàn)p53的蛋白水平上調(diào)，而且發(fā)現(xiàn)p53作用的靶蛋白Hsp70和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤結(jié)合蛋白的水平也上調(diào)，表明p53在毒素誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)中起了重要作用。 6.已有研究證明微囊藻毒素可以調(diào)節(jié)p53，ERK和tubulin等重要蛋白的磷酸化水平，而本研究證明微囊藻毒素還可以調(diào)節(jié)這些重要蛋白的蛋白水平，因此它們將受到微囊藻毒素的雙重影響而參與細(xì)胞對(duì)毒素的應(yīng)答反應(yīng)。