從蛋白水平探討微囊藻毒素的毒作用機制.pdf

1、自上世紀70年代以來，由于水體富營養(yǎng)化導致世界范圍內藍藻水華頻頻發(fā)生。由藍藻(主要是銅綠微囊藻)產生的毒素—微囊藻毒素對人類和家畜都產生了極為嚴重的影響。微囊藻毒素是一種環(huán)狀七肽類毒素，其中5個氨基酸為固定成分，一般結構為(D-Ala-L-X-erythro-β-methyl-D-isoAsp-L-Y-Adda-D-isoGlu-N-Methyldehydro-Ala)，其中Adda(3-amino-9-methoxy-2,6,8-tr

2、imethyl-10-phenyldeca-4,6-dienoicacid)是一種特殊的氨基酸，是微囊藻毒素生物活性表達所必需的基團。X，Y為兩種可變氨基酸，由此產生60多種同類物，其中存在較多、毒性較大的是微囊藻毒素-LR和RR，其中L，R分別為亮氨酸，精氨酸，分別縮寫為MC-LR和MC-RR。 同位素示蹤顯示，用氚標記的微囊藻毒素進入動物體內后，主要分布在肝臟，但發(fā)現(xiàn)腸道和腎臟這兩個器官內也有不同程度的蓄積，提示這三個臟器是

3、可能都受毒素的影響。而且微囊藻毒素對很多細胞都有毒理學效應，包括肝細胞、腎細胞、成纖維細胞、內皮細胞、上皮細胞以及淋巴細胞等。最近，研究人員首次發(fā)現(xiàn)微囊藻毒素能在無脊椎動物(魚、蝦、蟹等)性腺中大量累積，性腺是除肝臟外的第2個靶器官，微囊藻毒素可在卵中大量存在并傳遞到后代，因此微囊藻毒素對包括人類在內的哺乳動物生殖的影響也應該受到關注和重視。同時微囊藻毒素可以在魚類、蝦、蟹體內富集，沿食物鏈出現(xiàn)生物放大現(xiàn)象，進而影響整個水生生態(tài)系統(tǒng)和人

4、類健康。 微囊藻毒素由于它們的高急性毒性、強促癌活性以及與人類癌癥發(fā)生的相關性而受到全球的關注。到目前為止，微囊藻毒素所誘導的肝細胞毒性和強促癌活性的確切機制尚不明確。微囊藻毒素是一種很強的蛋白磷酸酶1和2A的抑制劑，通過抑制蛋白磷酸酶的活性而導致細胞蛋白的過度磷酸化，普遍認為這與微囊藻毒素的強促癌活性有關。它也可以解釋微囊藻毒素引起的一些細胞學效應，如導致細胞蛋白的過度磷酸化，進而導致細胞骨架的重組。 近年來許多研究都

5、表明微囊藻毒素能誘導一系列細胞發(fā)生凋亡，并呈現(xiàn)典型的細胞凋亡的形態(tài)學和生化改變，包括細胞皺縮，染色質濃縮，磷酯酰絲氨酸的外露，并進而形成凋亡小體，以及DNA的片段化改變。雖然許多研究表明蛋白磷酸化的改變、caspase的激活、以及氧化應激和線粒體功能的改變可能在微囊藻毒素誘導的細胞凋亡中起了很大的作用，但到目前為止，其確切機制尚不完全明確。 我們實驗室近年來也致力于研究Bcl-2蛋白家族和p53在MC-LR誘導的細胞凋亡中的作用

6、。大鼠體內和體外實驗都說明MC-LR能誘導p53和Bax的表達，有趣的是，在體外研究中，MC-LR能抑制Bcl-2的表達，但在體內研究中，MC-LR暴露后大鼠肝臟的Bcl-2的表達沒有明顯的變化。體內和體外的毒作用機理不一致，進一步表明微囊藻毒素毒理學機制的復雜性。 目前有很多研究都側重于分別研究單個分子與微囊藻毒素誘導的毒性機制的關系，如ATP合成酶的β亞基、Bcl-2和p53等都是毒素作用的響應蛋白，但是作為一種外來污染物進

7、入細胞后，其對細胞內功能的影響必然是十分廣泛的，更多的毒素作用后的響應蛋白是否存在?為了更好的闡明微囊藻毒素誘導后參與細胞應答反應機制的蛋白，傳統(tǒng)的對單個蛋白質進行研究的方式顯然無法滿足高通量篩選毒素作用后響應蛋白的要求。以雙向電泳(2-DE)作為分離技術和質譜作為鑒定技術的蛋白質組學的方法能同時分離細胞內幾千個蛋白，并能研究翻譯后修飾以及蛋白的相互作用，在毒理學領域受到廣泛的應用(Molleretal.，2001)。 因此，在

8、本研究中應用PI/AnnexinV-FITC雙染色的方法，借助于流式細胞儀分析微囊藻毒素誘導的細胞凋亡的改變，同時，應用熒光標記的caspase-3特異性抑制劑DEVD-FMK研究在此過程中凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3的變化，探討在微囊藻毒素誘導的細胞凋亡中caspase-3的作用。應用雙向電泳和基質輔助激光解吸飛行時間質譜(MALDI-TOF)相結合的蛋白質組學方法來篩選微囊藻毒素暴露后的差異表達蛋白，研究可能存在的差異表達蛋白與毒

9、素濃度、作用時間的關系，找尋對微囊藻毒素有特異反應的蛋白。用Westernblot來分析差異表達蛋白的改變是否與蛋白質組學得到的結果一致，進一步驗證蛋白質組學研究得到的結果。通過生物信息學方法對差異蛋白進行分類，探討不同功能蛋白對微囊藻毒素的響應可能對細胞產生的毒性影響。 主要結果：1.凋亡關鍵蛋白caspase-3參與微囊藻毒素誘導的細胞凋亡：微囊藻毒素能誘導腎細胞凋亡并呈現(xiàn)良好的劑量反應關系。同時能激活肝、腎這兩種細胞的ca

10、spase-3，而且兩種細胞的反應性不同，肝細胞更為敏感。凋亡的發(fā)生與caspase-3的激活有一定的相關性，說明caspase-3在微囊藻毒素誘導的細胞凋亡中起了重要的作用。 2.用蛋白質組學方法檢測到MC-RR作用后細胞內一系列蛋白水平發(fā)生改變：通過蛋白質組學分析，在量效研究中發(fā)現(xiàn)用不同濃度MC-RR處理后，一共有89個蛋白點的表達發(fā)生了改變，其中66個通過MALDI-TOFMS得到了初步的鑒定。在時效研究中發(fā)現(xiàn)用1μMMC

11、-RR處理不同時間后一共有119個蛋白點的表達發(fā)生了改變，其中103個得到了成功鑒定。這些得到成功鑒定的蛋白質功能涉及面非常廣，包括與信號轉導相關的蛋白，凋亡相關蛋白，細胞骨架蛋白，酶及酶活調節(jié)相關蛋白等，表明微囊藻毒素對細胞產生了廣泛而深刻的影響。 3.差異表達蛋白質的Westernblot驗證：從成功得到質譜鑒定的蛋白質中，選擇p53和ERK進行westernblot驗證。結果表明westernblot分析得到的結果與蛋白質

12、組學分析得到的結果是一致的，說明本實驗中蛋白質組分析得到的結果是可信的。 4.微囊藻毒素不僅能抑制PP2A的活性，而且還能影響其蛋白水平：在時效研究中發(fā)現(xiàn)微囊藻毒素能改變PP2A調節(jié)亞基A的蛋白水平。 5.微囊藻毒素作用后既影響其磷酸化水平，又影響其蛋白水平的重要蛋白：本研究中發(fā)現(xiàn)微囊藻毒素能影響ERK、p53和tubulin的蛋白水平，而且已有研究表明這些蛋白的磷酸化水平都受微囊藻毒素的調節(jié)。 6.本研究中發(fā)現(xiàn)

13、的未見報道與微囊藻毒素毒作用機制相關的蛋白：如真核翻譯起始因子eIF5A、細胞周期蛋白依賴激酶CDK4、tau蛋白和peroxiredoxin蛋白等，目前為止未見有報道證明這些蛋白與MC-RR的致毒機理相關，為進一步研究MC-RR的致毒機理提供了線索。 主要結論： 1.Caspase-3可能參與了微囊藻毒素誘導的細胞凋亡過程，但不是唯一的關鍵酶，毒素誘導的凋亡中還可能還涉及到其它的蛋白酶，caspase-3是否參與這一過

14、程可能依賴于細胞類型和毒素作用時間。 2.用蛋白質組學方法研究微囊藻毒素暴露后細胞應答反應的機制，量效研究中發(fā)現(xiàn)有89個蛋白的表達量發(fā)生了改變，而時效研究中發(fā)現(xiàn)有119個蛋白的表達量發(fā)生了改變，說明微囊藻毒素作用后細胞內發(fā)生了廣泛的變化，有眾多蛋白參與了應答反應，這些蛋白涉及到細胞的不同功能。 3.研究發(fā)現(xiàn)僅有極少數(shù)蛋白有劑量依賴關系和時間依賴關系，說明不同濃度微囊藻毒素暴露及暴露不同時間后細胞應答反應機制是不一樣的，高

15、濃度微囊藻毒素作用后，細胞應答反應體系不是低濃度作用后的簡單放大，存在更為復雜的致毒機制，不同濃度微囊藻毒素作用不同時間后，可能激活細胞內不同的途徑來產生毒性效應。 4.微囊藻毒素能抑制PP2A活性這一發(fā)現(xiàn)在毒素毒理機制研究中是具有里程碑意義的，而本研究中首次發(fā)現(xiàn)微囊藻毒素還能改變PP2A蛋白水平。關鍵蛋白受到毒素雙重影響的發(fā)現(xiàn)，進一步揭示了微囊藻毒素毒作用的嚴重性和作用機制的復雜性。 5.量效研究中用不同濃度的微囊藻毒

16、素作用后p53蛋白水平均上調，同時具有劑量依賴關系，時效研究中也發(fā)現(xiàn)p53的蛋白水平上調，而且發(fā)現(xiàn)p53作用的靶蛋白Hsp70和視網膜母細胞瘤結合蛋白的水平也上調，表明p53在毒素誘導的細胞應答反應中起了重要作用。 6.已有研究證明微囊藻毒素可以調節(jié)p53，ERK和tubulin等重要蛋白的磷酸化水平，而本研究證明微囊藻毒素還可以調節(jié)這些重要蛋白的蛋白水平，因此它們將受到微囊藻毒素的雙重影響而參與細胞對毒素的應答反應。