EPA對(duì)人肝膽管癌FRH-0201細(xì)胞生長的抑制作用及其機(jī)制.pdf

1、含有兩個(gè)或兩個(gè)以上雙鍵的不飽和脂肪酸為多不飽和脂肪酸(PUFA)。國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PUFA在體外能殺死腫瘤細(xì)胞。根據(jù)雙鍵位置的不同，PUFA又可分為ω-3和ω-6兩種不飽和脂肪酸。ω-3多不飽和脂肪酸(ω-3PUFA)是人體必須的營養(yǎng)成分之一，也是參與細(xì)胞膜膜磷脂構(gòu)成和細(xì)胞內(nèi)代謝調(diào)控的重要結(jié)構(gòu)脂肪酸。體內(nèi)外藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)ω-3PUFA能抑制腫瘤的生長、侵襲及轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)某些抗癌藥物的療效，延長荷瘤宿主的生存時(shí)間。本課題組也在先前的研究中發(fā)現(xiàn)

2、DHA對(duì)人胃癌細(xì)胞AGS具有顯著的增殖抑制作用。ω-3PUFA的另一個(gè)成員為二十碳五烯酸(EPA)，許多體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究表明其對(duì)多種腫瘤具有抑制效應(yīng)。本課題以一株能較好地代表膽管癌原發(fā)灶細(xì)胞所有群體的膽管癌細(xì)胞FRH-0201為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，旨在研究EPA體外對(duì)該細(xì)胞株的增殖抑制作用及其機(jī)制。
　　 1、EPA對(duì)人肝膽管癌細(xì)胞株FRH-0201增殖的影響
　　 MTT法測(cè)定結(jié)果表明，EPA對(duì)FRH-0201細(xì)胞作用48小時(shí)后，

3、明顯抑制FRH-0201細(xì)胞增殖，最高抑制率達(dá)89.92±0.42％，IC50值為32.20±1.70μg/ml。各處理組細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察形態(tài)改變明顯，細(xì)胞開始皺縮，細(xì)胞間顆粒增多，死細(xì)胞增多。EPA對(duì)正常小鼠成纖維細(xì)胞L-929無明顯抑制作用，不同濃度組間及對(duì)照組OD值相比差異無顯著性(P>0.05)。
　　 臺(tái)盼藍(lán)拒染細(xì)胞數(shù)法測(cè)定生長曲線，發(fā)現(xiàn)EPA各濃度在0到96h間對(duì)FRH-0201細(xì)胞增殖均有抑制作用，并呈時(shí)間依

4、賴性。
　　 流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析結(jié)果表明，F(xiàn)RH-0201細(xì)胞經(jīng)EPA32、50、70μg/ml處理48小時(shí)后，其G0/G1期細(xì)胞百分比隨著EPA濃度的增加而上升，而S期和G2/M期細(xì)胞百分比則顯著下降。細(xì)胞阻滯在G0/G1期。
　　 2、EPA體外誘導(dǎo)人肝膽管癌細(xì)胞株FRH-0201細(xì)胞凋亡的作用
　　 吖啶橙染色后，在熒光顯微鏡下觀察，對(duì)照組FRH-0201細(xì)胞核DNA顯黃綠色均勻熒光，EPA各處理組細(xì)胞核或

5、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見致密的黃綠色熒光，甚至可見濃染的黃綠色碎片，呈現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化。
　　 透射電鏡觀察FRH-0201細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)EPA40μg/ml處理24h后，胞漿內(nèi)形成空泡，細(xì)胞核染色質(zhì)發(fā)生邊集固縮，在核膜周邊聚集形成高電子密度的質(zhì)塊，呈現(xiàn)典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)改變。
　　 AnnexinV/PI雙染法檢測(cè)凋亡細(xì)胞，結(jié)果顯示，EPA50、70μg/ml作用48小時(shí)的細(xì)胞凋亡率分別為37.3％和62.2％，

6、明顯高于正常對(duì)照組(1.3％)。EPA50、70μg/ml作用48小時(shí)的晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞比例分別為7.0％和7.5％。
　　 3、EPA體外誘導(dǎo)FRH-0201細(xì)胞凋亡機(jī)理的初步研究
　　 JC-1染色后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體跨膜電位(△ψm)的變化，結(jié)果顯示，F(xiàn)RH-0201細(xì)胞線粒體△ψm下降隨EPA劑量的增大而顯著增多(P<0.05)。
　　 FRH-0201細(xì)胞經(jīng)不同濃度EPA作用48小時(shí)后，免疫組

7、化法檢測(cè)其細(xì)胞色素c蛋白表達(dá)，蛋白陽性的細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒。計(jì)算機(jī)半定量分析結(jié)果顯示，EPA處理組細(xì)胞內(nèi)棕色顆粒的強(qiáng)弱和陽性細(xì)胞的比例明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05，p<0.001)。
　　 Westernblot檢測(cè)了EPA對(duì)FRH-0201細(xì)胞caspase-3和caspase-9蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，EPA不同濃度處理FRH-0201細(xì)胞24h后，caspase-3和caspase-

8、9蛋白表達(dá)顯著提高。
　　 4、EPA對(duì)FRH-0201細(xì)胞株SOD、MDA的影響
　　 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)FRH-0201細(xì)胞內(nèi)SOD(波長550nm)和MDA(波長532nm)的含量。結(jié)果顯示，各濃度EPA均能顯著或極顯著降低細(xì)胞的SOD活性(p<0.05；p<0.001)，用各濃度EPA處理后，F(xiàn)RH-0201細(xì)胞的MDA含量極顯著上升(p<0.01；p<0.001)。
　　 5、結(jié)論
　　 EP