AMPK介導(dǎo)離體心臟無鈣預(yù)處理保護作用研究.pdf

1、背景：
　　缺血-再灌注（ischemia-reperfusion,I/R）損傷是臨床上心臟融栓術(shù)及心外科手術(shù)后常見的心肌損傷，嚴重危害人類健康，近年來相關(guān)的心血管疾?。╟ardiovasculardisease）在我國的發(fā)病率和死亡率仍有上升的趨勢，而當(dāng)前的治療方法難以達到滿意效果，因此探索有效的防治措施尤為重要。心肌缺血預(yù)處理（ischemicpreconditioning,IP）是指在心臟經(jīng)歷較長時間缺血前，給予短暫的缺血-

2、再灌注交替數(shù)次循環(huán)處理，它可以產(chǎn)生顯著的抗I/R損傷作用，是目前發(fā)現(xiàn)的機體內(nèi)最強大的心肌保護機制之一。與之相對應(yīng)，若在缺血前給予離體心臟短暫的無鈣KH緩沖液（Ca2+-freeKrebs-Henseleitbuffersolution,無鈣KH液）灌注處理，也可以產(chǎn)生顯著的抗I/R損傷作用，這種方式稱為無鈣預(yù)處理（repetitiveCa2+depletionandrepletionforshortduration，CP），它是目前許多

3、實驗室研究鈣信號的重要手段，其心臟保護效應(yīng)的研究是當(dāng)前心血管研究領(lǐng)域的又一熱點，但具體機制尚不清楚。顯然，對IP和CP具體機制的闡明并加以利用，對缺血性心臟?。╥schemicheartdisease,IHD）的防治具有重要意義。
　　腺苷酸活化的蛋白激酶（AMP-activatedproteinkinase,AMPK）是細胞能量代謝的調(diào)節(jié)器，在心肌缺血時被快速激活，活化的AMPK能夠促進葡萄糖攝取，加速脂肪酸（freefatty

4、acid，F(xiàn)FA）氧化，抑制心肌細胞凋亡，對機體病理狀態(tài)下的心臟保護具有重要意義。乙酰輔酶A羧化酶（acetylCoAcarboxylase,ACC）是AMPK的下游靶分子之一，它的磷酸化水平可作為機體內(nèi)AMPK活化狀態(tài)的反應(yīng)，AMPK可磷酸化ACC使其失活，進而抑制FFA合成，促進其氧化，在預(yù)處理心肌保護中發(fā)揮重要作用。
　　本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，IP能夠激活反向鈉-鈣交換體（sodium/calciumexchanger,NC

5、X），引起胞內(nèi)鈣濃度短暫升高，產(chǎn)生心肌保護作用；IP期間采用NCX抑制劑KB-R7943阻斷離體心肌細胞NCX活性，可減弱NCX激動劑E4031的心肌保護作用。同時，胞內(nèi)鈣濃度升高可促進蛋白激酶C（proteinkinaseC,PKC）活化及其向胞膜的轉(zhuǎn)位，后者激活A(yù)MPK，增加葡萄糖轉(zhuǎn)運體4（glucosetransporter4,GLUT4）的蛋白表達，在NCX-鈣預(yù)處理心肌保護效應(yīng)中發(fā)揮重要作用。
　　然而，AMPK在CP心

6、肌保護中的作用尚不清楚，本課題在前期研究基礎(chǔ)上，進一步探討AMPK參與CP心肌保護的機制，及其與NCX和PKC激活之間的關(guān)系。研究結(jié)果為全面理解CP的生理學(xué)機制提供重要的理論支持，并在IHD等心血管疾病的防治方面具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。
　　目的：
　　(1)研究AMPK在CP對抗心肌I/R損傷中的作用；
　　(2)探討NCX和PKC是否參與AMPK介導(dǎo)CP的心肌保護作用。
　　方法：
　　成年S

7、prague-Dawley（SD）雄性大鼠，麻醉并肝素抗凝后，立即取心臟，行Langendorff離體心臟灌流。實驗中CP采用1min缺血-5min再灌注連續(xù)3個循環(huán)處理方式，IP采用5min無鈣KH液-5min正常KH液連續(xù)3個循環(huán)處理方式進行，全程記錄心臟血流動力學(xué)指標，灌流結(jié)束時留取心肌組織標本。利用AcqKnowledge3.8.1（BIOPACSystems,Inc）軟件記錄實驗全程的血流動力學(xué)指標，利用心肌組織2，3，5-氯

8、化三苯基四氮唑（2,3,5-Triphenyltetrazoliumchloride,TTC）染色方法檢測心肌損傷面積，利用Western技術(shù)檢測AMPK和ACC的總蛋白含量及其磷酸化水平。
　　結(jié)果：
　　(1)AMPK在CP和IP心臟功能保護中的作用：離體心臟在經(jīng)歷I/R后，左室舒張末壓（leftventricularend-diastolicpressure，LVEDP）顯著升高，而左室發(fā)展壓（leftventricu

9、lardevelopedpressure,LVDP）、左室內(nèi)壓變化（上升/下降）最大速率（maximumratesofincreaseanddecreaseinleftventricularpressure,±dp/dtmax）、心率-壓力乘積（ratepressureproduct,RPP）和冠脈流量（coronaryarteryflow,CF）均明顯降低；與I/R組相比，CP組和IP組心臟LVEDP明顯降低，CF、LVDP、±dp/

10、dtmax和RPP明顯升高；缺血前單獨使用AMPK抑制劑P5499對心臟功能和CF無顯著影響，但可明顯減弱CP和IP的心肌保護作用。
　　(2)P5499是AMPK的抑制劑，10μmol/L的P5499顯著減弱CP和IP心肌保護作用：離體心臟在經(jīng)歷I/R后，心肌損傷比例為（39.6±1.49）％；與對照預(yù)處理（Vehiclepretreatment,VP）組相比，CP組和IP組心肌損傷比例明顯降低，AMPK和ACC磷酸化水平明顯升

11、高；缺血前單獨使用P5499對心肌損傷面積及AMPK和ACC磷酸化水平均無顯著影響，但可以明顯抑制CP和IP的心肌保護作用。
　　(3)KB-R7943（簡稱：KB-R）是NCX的抑制劑，3μmol/L的KB-R顯著減弱CP和IP心肌保護作用：與VP組相比，CP組和IP組心肌損傷比例明顯降低，AMPK和ACC磷酸化水平明顯升高；缺血前單獨給予KB-R對心肌損傷面積及AMPK和ACC磷酸化水平均無顯著影響，但可以明顯抑制CP和IP的

12、心肌保護作用。
　　(4)Chelerythrinechloride（簡稱：CHE）是PKC的抑制劑，3μmol/L的CHE顯著減弱CP和IP心肌保護作用：與VP組相比，CP組和IP組心肌損傷比例明顯降低，AMPK和ACC磷酸化水平明顯升高；缺血前單獨給予CHE對心肌損傷面積及AMPK和ACC磷酸化水平均無顯著影響，但可以明顯抑制CP和IP的心肌保護作用。
　　結(jié)論：
　　本課題在驗證IP心肌保護作用中存在AMPK、N