羥苯磺酸鈣調(diào)控一氧化氮對ECV304細(xì)胞及糖尿病大鼠腎臟MMPs-TIMPs影響的研究.pdf

1、內(nèi)皮細(xì)胞及其細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的相互作用在維持正常組織結(jié)構(gòu)、功能及細(xì)胞生長、分化過程中有著非常重要意義。ECM不再被認(rèn)為是靜止不動的隔膜，而是處在不斷代謝更新、降解重塑的動態(tài)平衡中。ECM成分的變化參與了多種疾病的發(fā)生、發(fā)展。而基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)和金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)的平衡對ECM的構(gòu)成和病理改變有著十分重要的作用。一氧化氮(NO)是體內(nèi)調(diào)節(jié)細(xì)胞功能重要的信號分子，而在腎臟NO有著保護(hù)和損害的雙重作用，NO對內(nèi)皮細(xì)胞

2、合成MMPs/TIMPs是否有目前影響尚未見報道。羥苯磺酸鈣(calciumdobesilate，Cadb)是治療糖尿病微血管病變的經(jīng)典用藥并且被證實可以體外抑制糖尿病大鼠腎小球基底膜膠原合成而其機制尚不清楚。 本課題離體實驗研究NO對臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304細(xì)胞MMPs/TIMPs表達(dá)的影響和羥苯磺酸鈣調(diào)控ECV304細(xì)胞MMPs/TIMPs表達(dá)及其內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelialnitricoxidesynth

3、ase、eNOS)基因表達(dá)的關(guān)系。在體實驗觀察羥苯磺酸鈣對不同病程的STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎臟NO-NOS系統(tǒng)、腎小球基底膜病理改變、腎臟eNOS、MMPs/TIMPs基因和蛋白的表達(dá)的關(guān)系。旨在探討羥苯磺酸鈣調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞MMPs/TIMPs表達(dá)及其誘導(dǎo)的基底膜降解、逆轉(zhuǎn)糖尿病大鼠腎小球基底膜增厚的分子生物學(xué)機制，為糖尿病腎病的病因?qū)W提供新的認(rèn)識，亦為臨床防治糖尿病腎病提供新的理論基礎(chǔ)。本實驗對ECV304細(xì)胞及STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模

4、型動態(tài)觀察如下：(1)NO前體L-精氨酸(L-Arg)與ECV304細(xì)胞MMP-2、9及TIMP-1、2表達(dá)的關(guān)系；(2)一氧化氮合酶(NOS)抑制劑L-NG-硝基-精氨酸(LNNA)對內(nèi)源性NO調(diào)控ECV304細(xì)胞MMP-2、9及TIMP-1、2表達(dá)的影響；(3)羥苯磺酸鈣對ECV304細(xì)胞NO-NOS活性的影響；(4)羥苯磺酸鈣對ECV304細(xì)胞eNOS基因表達(dá)的影響；(5)羥苯磺酸鈣對ECV304細(xì)胞MMP-2、9及TIMP-1、

5、2表達(dá)的影響；(6)NOS抑制劑對羥苯磺酸鈣誘導(dǎo)ECV304細(xì)胞MMP-2、9及TIMP-1、2基因表達(dá)的影響；(7)糖尿病大鼠腎臟NO、NOS活性及eNOSmRNA、蛋白的表達(dá)；(8)糖尿病大鼠腎臟MMP-2、9及TIMP-1、2mRNA、蛋白表達(dá)及膠原Ⅳ蛋白、腎小球基底膜病變的變化；(9)羥苯磺酸鈣對糖尿病大鼠腎臟eNOSmRNA、蛋白表達(dá)的影響；(10)羥苯磺酸鈣對糖尿病大鼠腎臟MMP-2、9及TIMP-1、2mRNA、蛋白表達(dá)及

6、膠原Ⅳ蛋白、腎小球基底膜病變的影響； 研究結(jié)果表明：(1)L-Arg可上調(diào)ECV304細(xì)胞的MMP-2mRNA/GAPDHmRNA比值，其作用呈濃度依賴性。10-5、10-4和10-3mol/L組的MMP-2mRNA/GAPDHmRNA比值(分別為1.57±0.09、2.53±0.11和2.43±0.09)較對照組(0.81±0.04)表達(dá)均顯著增強(P＜0.01)。L-Arg對MMP-9mRNA/GAPHD無明顯影響。

7、 (2)L-Arg以濃度依賴的方式下調(diào)ECV304細(xì)胞的的TIMP-1mRNA表達(dá)。10-5、10-4和10-3mol/LL-Arg組TIMP-1mRNA/GAPDHmRNA比值(分別為0.59±0.04、0.47±0.03和0.35±0.03)表達(dá)均較對照組(0.69±0.05)顯著降低(P＜0.01)。 (3)L-Arg以濃度依賴的方式下調(diào)ECV304細(xì)胞的的TIMP-2mRNA表達(dá)。10-5、10-4和10-3mol/LL

8、-Arg組TIMP-2mRNA/GAPDHmRNA比值(分別為0.56±0.05、0.39±0.03和0.19±0.01)均較對照組(0.92±0.07)顯著降低(P＜0.01)。 (4)10-4mmol/LNOS抑制劑LNNA可以阻斷L-Arg上調(diào)MMP-2mRNA表達(dá)及下調(diào)TIMP-1、-2mRNA表達(dá)的作用。 (5)羥苯磺酸鈣上調(diào)eNOSmRNA表達(dá)，其作用呈濃度依賴性和時間依賴性。0.25×10-3、0.5×10

9、-3和1.0×10-3mol/L組eNOSmRNA/GAPDHmRNA比值(分別為0.52±0.04、0.86±0.05和0.89±0.07)較對照組(0.30±0.02)比較，差異均有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。隨著羥苯磺酸鈣作用時間的延長，24h、36h和48h組ECV304細(xì)胞的eNOSmRNA表達(dá)均較12h組和對照組有顯著性增高(P＜0.01)。 (6)羥苯磺酸鈣可上調(diào)ECV304細(xì)胞的MMP-2mRNA表達(dá)，其作

10、用呈濃度依賴性。0.25×10-3、0.5×10-3和1.0×10-3mol/L羥苯磺酸鈣組MMP-2/GAPDHmRNA比值(分別為0.89±0.05、1.87±0.09和1.95±0.09)均較對照組(0.78±0.04)顯著增高(P＜0.01)，對MMP-9mRNA表達(dá)無顯著影響。 (7)羥苯磺酸鈣可下調(diào)ECV304細(xì)胞的TIMP-1、-2mRNA表達(dá)，其作用呈濃度依賴性。0.5×10-3和1.0×10-3mol/L羥苯磺

11、酸鈣組ECV304細(xì)胞的TIMP-1mRNA/GAPDHmRNA比值分別為0.71±0.05、0.62±0.04，均較對照組(0.96±0.07)有顯著性差異(P＜0.01)。0.25×10-3、0.5×10-3和1.0×10-3mol/L羥苯磺酸鈣組ECV304細(xì)胞的TIMP-2mRNA/GAPDHmRNA比值分別為0.61±0.04、0.39±0.03、0.23±0.02，均較對照組(0.71±0.05)有顯著性降低(P＜0.01)

12、。 (8)10-4mmol/LNOS抑制劑LNNA可阻斷羥苯磺酸鈣上調(diào)MMP-2mRNA的作用(P＜0.01)。 (9)10-4mmol/LNOS抑制劑LNNA可阻斷羥苯磺酸鈣下調(diào)TIMP-1、-2mRNA表達(dá)的作用(P＜0.05)。 (10)糖尿病大鼠模型組4周時腎臟NO含量、NOS活性較對照組顯著增加(P＜0.01)；12周時NO含量、NOS活性較對照組顯著降低(P＜0.01)。 (11)糖尿病大鼠模

13、型組4周時腎臟eNOSmRNA、蛋白表達(dá)較正常對照組顯著增加(P＜0.01)，12周時eNOSmRNA、蛋白表達(dá)較正常對照組顯著增加降低(P＜0.01)。 (12)糖尿病大鼠模型組4周時腎臟MMP-2、9mRNA、蛋白表達(dá)較正常對照組顯著增加(P＜0.01)，12周時MMP-2、9mRNA、蛋白表達(dá)較正常對照組顯著增加降低(P＜0.01)； (13)糖尿病大鼠模型組4周時腎臟膠原Ⅳ表達(dá)、基底膜厚度正常，12周腎臟膠原Ⅳ表

14、達(dá)增加、基底膜厚度增加； (14)羥苯磺酸鈣可以上調(diào)糖尿病大鼠腎臟4周、12周的NO含量、NOS活性； (15)羥苯磺酸鈣可以上調(diào)糖尿病大鼠腎臟4周、12周的eNOSmRNA、蛋白表達(dá)； (16)羥苯磺酸鈣可以上調(diào)糖尿病大鼠腎臟4周、12周的MMP-2mRNA、蛋白表達(dá)，對MMP-9mRNA、蛋白表達(dá)無影響； (17)羥苯磺酸鈣可以下調(diào)糖尿病大鼠腎臟12周的TIMP-1、-2mRNA、蛋白表達(dá)，對4周時表

15、達(dá)無影響。 (18)羥苯磺酸鈣可以減少糖尿病大鼠12周時腎臟膠原Ⅳ的表達(dá)，減輕腎小球基底膜增厚。 上述結(jié)果提示：(1)L-Arg可以呈濃度依賴方式上調(diào)MMP-2、下調(diào)TIMP-1、-2mRNA表達(dá)，表明增加內(nèi)源性NO有助于增加膠原的降解；(2)羥苯磺酸鈣具有濃度依賴方式上調(diào)ECV304細(xì)胞eNOSmRNA表達(dá)的作用；(3)羥苯磺酸鈣可以濃度依賴方式上調(diào)ECV304細(xì)胞MMP-2mRNA表達(dá)，下調(diào)TIMP-1、2mRNA表

16、達(dá)，從而促進(jìn)MMP-2、-9降解血管基底膜膠原的能力；這個調(diào)節(jié)途徑部分由eNOS合成NO所介導(dǎo)；(4)一氧化氮對糖尿病腎病有著保護(hù)和損害的雙重作用并通過調(diào)節(jié)MMP-2、MMP-9的作用參與糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展。(5)羥苯磺酸鈣可以通過促進(jìn)糖尿病大鼠12周腎臟NO-NOS活性、eNOS表達(dá)來增加MMP-2表達(dá)、抑制TIMP-1、2表達(dá)，從而促進(jìn)腎小球基底膜膠原Ⅳ的降解，改善糖尿病腎病晚期基底膜病變。 綜上所述，不難看出內(nèi)源性NO