ADAM-17在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及靶向抑制ADAM-17對(duì)腎癌Notch通路的特異性影響以及分子機(jī)制的研究.pdf

1、背景:腎細(xì)胞癌是最常見(jiàn)的腎臟惡性實(shí)體腫瘤，是起源于腎實(shí)質(zhì)泌尿小管上皮的惡性腫瘤。
　　目前的靶向藥物如索拉菲尼、舒尼替尼等多基于選擇性的抑制VEGFR2、3或者KIT、VEGFR-1等作用于腎癌細(xì)胞的多種信號(hào)通路從而發(fā)揮抗腫瘤作用，其中最重要的通路就是Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑。ADAM-17又名TACE作為一種早期發(fā)現(xiàn)的TNF-α抑制劑，研究表明，在白血病中Notch1蛋白的釋放依賴(lài)于ADAM-17對(duì)于Notch信號(hào)途徑的作用，揭示

2、了ADAM-17在Notch通路中的重要作用，其在Notch通路S2位點(diǎn)中起到了關(guān)鍵酶的作用。ADAM-17作為天然金屬蛋白的一種，而Marimastat，是金屬蛋白酶家族中唯一可抑制TACE的蛋白，Marimastat主要作用是能緊密連接基底膜，抑制TNF-α轉(zhuǎn)化酶，通過(guò)穩(wěn)定細(xì)胞表面TNF-α受體誘導(dǎo)程序性死亡。而由于其對(duì)抗TACE(ADAM-17)的作用，其通過(guò)Notch信號(hào)通路對(duì)腫瘤也引起了廣泛關(guān)注。
　　實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路為，與

3、ADAM-17在胞外S2位點(diǎn)的切割效應(yīng)相比，γ分泌酶對(duì)Notch的S3位點(diǎn)切割位于跨膜區(qū)，跨膜區(qū)可以收到有多種信號(hào)通路的影響，由于腫瘤細(xì)胞信號(hào)通路是一個(gè)復(fù)雜的立體的結(jié)構(gòu)，各信號(hào)通路有許多已知的、未知的相互影響，應(yīng)用γ分泌酶抑制劑針對(duì)跨膜區(qū)γ分泌酶的作用不可避免的產(chǎn)生對(duì)其他信號(hào)通路的影響;而對(duì)于位于胞外區(qū)的S2位點(diǎn)來(lái)說(shuō)，其受到影響的可能性遠(yuǎn)比S3位點(diǎn)要小，所以，針對(duì)S2位點(diǎn)的阻滯應(yīng)該會(huì)有更強(qiáng)的具有的特異性，與γ分泌酶抑制劑相比針對(duì)ADAM

4、-17進(jìn)行抑制，在Notch通路中可以達(dá)到更好的抑制效果，對(duì)未來(lái)腎細(xì)胞癌的靶向抑制提供新的思路。
　　研究目的:腎腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚不清楚，Notch信號(hào)通路被認(rèn)為在其中起到重要作用，本研究旨在研究Notch通路關(guān)鍵酶ADAM-17(TACE)在腎癌組織中的表達(dá)以及Notch通路的兩種抑制劑對(duì)腎癌786-O細(xì)胞以及OS-RC-2細(xì)胞增殖以及細(xì)胞侵襲影響的特異性研究
　　方法:1、ADAM-17在腎癌組織中的表達(dá)
　　

5、1.1腎癌組織的提取
　　收集2011年10月至2012年12月于山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院泌尿微創(chuàng)科入住的腎腫瘤患者手術(shù)標(biāo)本共67例，所有診斷由山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院病理科石蠟切片確診，同時(shí)收集癌旁正常腎臟組織共10例;手術(shù)方式為開(kāi)放腎癌根治性切除術(shù)或者手助腹腔鏡腎癌根治性切除術(shù)。手術(shù)患者均采用2009年AJCC的TNM分期和2004 WHO分級(jí)系統(tǒng)評(píng)價(jià)腎癌的臨床分期，并根據(jù)臨床分期進(jìn)行分組。
　　1.2腎癌組織中ADAM-17的

6、免疫組化檢測(cè)
　　收集腎癌組織標(biāo)本及正常腎臟組織標(biāo)本后，選用兔抗人ADAM-17多克隆抗體，嚴(yán)格按照Super Polymer-二步法IHC試劑盒的方法進(jìn)行脫蠟水化、抗原修復(fù)、IHC試劑盒實(shí)驗(yàn)、蘇木精復(fù)染、DAB顯色、脫水透明、顯微成像系統(tǒng)拍照。ADAM-17陽(yáng)性表達(dá)主要集中在細(xì)胞膜周?chē)旧珵樽丶t色，而正常腎臟組織中腎臟細(xì)胞排列規(guī)整，無(wú)核分裂像，細(xì)胞周?chē)鸁o(wú)此類(lèi)染色表達(dá)情況，并統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性例數(shù)。
　　1.3 Western bl

7、ot方法檢測(cè)不同分期腎癌組織中ADAM-17的表達(dá)情況
　　將收集的腎癌組織根據(jù)不同臨床分期進(jìn)行分組，其中臨床Ⅰ期、Ⅱ期腎癌組織作為一組、Ⅲ期與Ⅳ期作為一組，正常腎臟組織作為一組，不同分期腎癌組織隨機(jī)抽取3例，分別提取總蛋白，腎癌組與正常腎組織組分別進(jìn)行Western blot檢測(cè)觀察各組ADAM-17蛋白表達(dá)情況。以GAPDH作為內(nèi)參照，以各組ADAM-17與GAPDH的比值表示各組ADAM-17蛋白表達(dá)水平。用掃描儀掃描膠片得

8、到各個(gè)蛋白條帶圖，將得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入IPP6.0圖像處理軟件，通過(guò)軟件中的count/size算出各蛋白個(gè)條帶的光密度值IOD(Integral OpticalDensity)，然后計(jì)算各個(gè)目的蛋白條帶和與之相對(duì)應(yīng)的內(nèi)參條帶的灰度值的比。
　　2、抑制ADAM-17對(duì)腎癌Notch通路調(diào)控特異性的研究
　　2.1腎癌細(xì)胞株的選擇
　　選取腎癌786-O細(xì)胞株以及腎癌OS-RC-2細(xì)胞株，二者均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫(kù)

9、。兩類(lèi)細(xì)胞均嚴(yán)格按照細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)程進(jìn)行復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代以及凍存。
　　2.2實(shí)驗(yàn)試劑處理及細(xì)胞分組
　　ADAM-17抑制劑Marimastat規(guī)格1mg購(gòu)自英國(guó)Tocris公司;DAPT;格5mg購(gòu)自美國(guó)EMD bioscience公司。將Marimastat及DAPT試劑于常溫下解凍，分別溶于DMSO中，根據(jù)體積比配置成Marimastat1μmol/L，2μmol/L，3μmol/L以及DAPT1μmol/L，2μmol

10、/L，3μmol/濃度溶液4℃冰箱保存待用。于細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)各濃度試劑均取2ml加入處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的786-O以及OS-RC-2細(xì)胞內(nèi)處理24h作為實(shí)驗(yàn)組;對(duì)照組僅加入2m11640培養(yǎng)基。
　　2.3 Western blot方法檢測(cè)兩類(lèi)抑制劑對(duì)786-O細(xì)胞以及OS-RC-2細(xì)胞Notch通路的影響
　　分別將不同濃度的Marimastat以及DAPT加入到培養(yǎng)中的786-O細(xì)胞以及OS-RC-2細(xì)胞中，對(duì)其N(xiāo)otch1、H

11、es-1蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，取未經(jīng)處理的細(xì)胞作為對(duì)照組作比較，蛋白下降程度我們用測(cè)量的蛋白濃度-對(duì)照組蛋白濃度計(jì)算，下降程度均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示((x)±σ)，實(shí)驗(yàn)步驟參考方法1.3進(jìn)行。
　　2.4 CCK-8法檢測(cè)經(jīng)兩類(lèi)抑制劑處理后的細(xì)胞增殖情況
　　取經(jīng)過(guò)不同濃度Marimastat以及DAPT處理后的786-O細(xì)胞以及OS-RC-2細(xì)胞，均以3×105/mL的密度種于普通96孔板中，每孔加入100μ l細(xì)胞懸液。24h后用

12、CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力。酶標(biāo)儀于450nm處檢測(cè)0D值情況。下降程度以實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)減去對(duì)照組數(shù)據(jù)，取各組實(shí)驗(yàn)值的均數(shù)表示，每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。
　　2.5 Transwell侵襲小室檢測(cè)兩類(lèi)抑制劑對(duì)786-O細(xì)胞侵襲性的影響
　　Transwell試劑盒購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Corning公司。我們選取腎癌786-O細(xì)胞分別經(jīng)1μmol/L，2μmol/L，3μmol/L的Marimastat以及相同濃度DAPT處理，對(duì)照組不進(jìn)行任何處

13、理，經(jīng)過(guò)Transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)，在400倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)5個(gè)視野觀察穿過(guò)聚碳酸酯膜細(xì)胞的個(gè)數(shù)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±σ)表示。
　　結(jié)果:1.ADAM-17在腎癌組織中的表達(dá)
　　全部67例不同分期腎細(xì)胞癌組織及正常腎組織均完成正常免疫組化程序，通過(guò)免疫組化染色的方法發(fā)現(xiàn)，在不同TNM分期腎癌組織中，ADAM-17呈高表達(dá)，全部67例中陽(yáng)性表達(dá)為43例，占64.18％，而ADAM-17陰性表達(dá)者僅有24例，占35

14、.82％，通過(guò)對(duì)上述計(jì)數(shù)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，在腎癌組織中，ADAM-17陽(yáng)性表達(dá)比例增多，差距有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=16.39 P＜0.01）。在留取的10例腎癌旁正常的腎臟組織中，ADAM-17無(wú)一例呈表達(dá)。在Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期與Ⅳ期ADAM-17陽(yáng)性表達(dá)的腎癌中，進(jìn)行Western blot檢測(cè)，其相對(duì)光密度值分別為Ⅰ期腎癌(0.67±0.11)、Ⅱ期腎癌(0.73±0.31)、Ⅲ期腎癌(0.79±0.25)與Ⅳ期腎癌(0.89±0

15、.09)。
　　2.抑制ADAM-17對(duì)腎癌Notch通路調(diào)控特異性的研究
　　發(fā)現(xiàn)于無(wú)論經(jīng)過(guò)Marimastat或者DAPT處理的兩類(lèi)細(xì)胞，其N(xiāo)otch1、Hes-1蛋白表達(dá)均明顯下降(P＜0.05)，但是，經(jīng)Marimastat處理的786-O細(xì)胞，比較經(jīng)過(guò)各濃度DAPT處理后Notch1蛋白、Hes-1蛋白下降更為顯著;在OS-RC-2細(xì)胞中，也得到了相似的結(jié)果，經(jīng)過(guò)Marimastat處理后，腎癌細(xì)胞Notch1、H

16、es-1蛋白的下降程度，相比經(jīng)DAPT處理后的下降程度要更大（786-O P＜0.05，OS-RC-2 P＜0.05）。并且，在相同濃度(1-4μmol/L)下，經(jīng)過(guò)Marimastat處理的兩類(lèi)細(xì)胞兩種蛋白濃度比較經(jīng)過(guò)DAPT處理的下降程度更大，差距有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05 P＜005)。在cck-8實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)兩類(lèi)細(xì)胞經(jīng)過(guò)上述兩種抑制劑處理后，其OD值均有明顯下降，與此同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，在相同劑量下，經(jīng)過(guò)Marimastat處理的786

17、-O細(xì)胞相較于DAPT處理的細(xì)胞，OD值下降程度的更小，而相同的情況也出現(xiàn)在OS-RC-2細(xì)胞里，且經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異與計(jì)量呈相關(guān)性(r=0.991，P＜0.05，r=0.991，P＜0.05)。
　　結(jié)論:1、ADAM-17在腎癌組織中呈高表達(dá)，ADAM-17陽(yáng)性表達(dá)隨腫瘤分期的增加其表達(dá)相應(yīng)增加
　　2、對(duì)于高分期腎細(xì)胞癌，ADAM-17的陽(yáng)性表達(dá)能上調(diào)腎癌細(xì)胞增殖，進(jìn)而影響腎癌的侵襲及發(fā)展
　　3、抑制ADAM

18、-17表達(dá)可能成為腎癌靶向治療的新位點(diǎn)
　　4、Marimastat以及DAPT均可以降低Notch1蛋白以及Hes-1蛋白的表達(dá)，降低786-O細(xì)胞以及OS-RC-2細(xì)胞的增殖能力，在786-O細(xì)胞中可以降低癌細(xì)胞侵襲性以及提高其凋亡率
　　5、Marimastat對(duì)于兩類(lèi)細(xì)胞Notch通路、細(xì)胞侵襲性以及細(xì)胞周期及凋亡率的影響比DAPT要更為顯著，Marimastat對(duì)于腎癌細(xì)胞Notch通路影響以及腎癌發(fā)生發(fā)展的過(guò)程具