腎透明細(xì)胞癌分子靶向治療中Sunitinib誘導(dǎo)細(xì)胞衰老和Klotho抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的分子機制研究.pdf

1、腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma，RCC)簡稱腎癌，是起源于腎小管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，約占成人腎惡性腫瘤的90％。組織學(xué)上，腎癌表現(xiàn)為一系列具有獨特的形態(tài)和遺傳特征的亞型。腎透明細(xì)胞癌（clear-cell renal cell carcinoma，CCRCC）是其中最常見的類型，起源于近曲小管上皮，占腎癌的70～80％。腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展與VHL（von Hippel-Lindau）抑癌基因缺陷相關(guān)。pVHL突變

2、導(dǎo)致缺氧誘導(dǎo)因子-α(hypoxia-inducible factor，HIF-α)穩(wěn)定性增加。HIF-α進入核內(nèi)與HIF-β形成復(fù)合物轉(zhuǎn)錄激活一系列缺氧相關(guān)基因，進而促進腫瘤血管生成(VEGF，EPO)，腫瘤細(xì)胞生長(TGF-α，PDGF-β，Cyclin D)和糖代謝(GLUT1)。從而，為針對VHL通路的靶向治療提供了強有力的理論依據(jù)。
　　舒尼替尼(Sunitinib，SU011248)是靶向VHL通路的一種小分子多靶點受

3、體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases，RTKs)抑制劑。已有研究表明舒尼替尼的主要作用靶點是表達(dá)在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞及周細(xì)胞的血管內(nèi)皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)等，在抑制腫瘤血管形成過程中起重要作用。隨著舒尼替尼廣泛用于晚期腎癌的治療，其發(fā)揮治療效用及最終發(fā)生耐藥的功能意義、分子機制亟待闡明，以克服耐藥、鞏固療效，更好進行個

4、體化靶向治療。本研究第一部分圍繞舒尼替尼治療作用及其潛在機制展開。
　　雖然VHL通路的分子靶向治療取得了長足的進步，一定程度上延長了患者的生存時間，但總有效率僅為20～30％，并且存在治療期間病情繼續(xù)進展，不良反應(yīng)明顯等缺陷。因此，更深入地對腎癌病理學(xué)及分子生物學(xué)進行研究，有助于改進現(xiàn)有治療手段并探索新的、行之有效的治療靶點。Klotho作為特異性表達(dá)在腎小管上皮的抗衰老蛋白，主要參與調(diào)節(jié)鈣磷代謝和能量代謝。盡管近年來Kloth

5、o作為腫瘤抑制基因的作用引起諸多關(guān)注，但對于Klotho在腎癌發(fā)生中的作用及其機制目前尚不明確。本研究主要圍繞Klotho在腎癌中的作用及潛在的分子機制展開。
　　在本研究的第一部分，多靶點酪氨酸激酶抑制劑舒尼替尼已被用作轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌(metastatic renal cell carcinoma，mRCC)治療的一線藥物，但其發(fā)揮治療效用的具體分子機制和功能效應(yīng)仍不清楚。我們目前的研究發(fā)現(xiàn)舒尼替尼處理后的腎癌細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的衰

6、老特征，包括衰老相關(guān)的β半乳糖苷酶(SA-β-gal)活性增強，衰老的分子標(biāo)志DcR2、Dec1表達(dá)增加，以及出現(xiàn)衰老相關(guān)的分泌表型(SASP)，如促炎癥細(xì)胞因子白介素-1α（IL-1α），白介素-6(IL-6)和白介素-8(IL-8)的分泌增加。同時舒尼替尼可以抑制腎癌細(xì)胞的增殖，G1-S期的細(xì)胞周期阻滯和DNA損傷反應(yīng)，進一步證明舒尼替尼誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞衰老的治療意義。機制研究表明舒尼替尼產(chǎn)生的治療誘導(dǎo)衰老(therapy-induce

7、d senescence，TIS)效應(yīng)主要歸因于其對Raf-1/NF-κB抑制所導(dǎo)致p53/Dec1信號通路活化。進一步應(yīng)用裸鼠皮下移植瘤實驗證實了舒尼替尼治療后可以顯著抑制腫瘤生長及延長總生存期，并伴隨著腫瘤組織p53、Dec1蛋白水平和SA-β-gal活性上調(diào)，Raf-1、Ki67蛋白水平下調(diào)。最后在接受舒尼替尼新輔助治療腎癌患者腫瘤組織樣本中驗證了類似的現(xiàn)象。結(jié)論:這部分研究闡述了舒尼替尼發(fā)揮治療效用可能是由于通過抑制Raf-1/

8、NF-κB活性導(dǎo)致p53/Dec1信號通路活化，最終產(chǎn)生治療誘導(dǎo)衰老效應(yīng)。
　　在本研究的第二部分，Klotho是特異性表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞的抗衰老蛋白。已有研究表明Klotho在多種腫瘤中都發(fā)揮腫瘤抑制基因的作用，但在腎癌中潛在作用和分子機制還有待闡明。瘤內(nèi)Klotho高表達(dá)與腫瘤大小，TNM分期和核分級呈負(fù)相關(guān)，Klotho高表達(dá)還預(yù)示著腎癌病人較好的預(yù)后。高表達(dá)Klotho的RCC患者的總生存率顯著高于低表達(dá)的患者。在腎癌細(xì)

9、胞中過表達(dá)Klotho可使腫瘤細(xì)胞形態(tài)從間質(zhì)型轉(zhuǎn)化為上皮型、上皮細(xì)胞標(biāo)志分子(如E-cadherin)上調(diào)、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志分子(如N-cadherin、vimentin)下調(diào)，提示Klotho表達(dá)可誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)—上皮轉(zhuǎn)化（mesenchymal-epithe lial transition，MET）。進一步研究發(fā)現(xiàn)表達(dá)Klotho介導(dǎo)的這種功能并不依賴于其特有的α-2，6唾液酸酶活性。此外，過Klotho表達(dá)通過抑制PI3K/Ak

10、t/GSK3β信號通路下調(diào)Snail蛋白水平，反之敲除Klotho可以上調(diào)Snail蛋白水平。PI3K/Akt信號通路的特異性抑制劑LY294002，GSK3β的特異性抑制劑LiC1可以分別重現(xiàn)過表達(dá)和敲除Klotho對Snail蛋白水平的影響。最后通過體外細(xì)胞劃痕試驗，Transwell細(xì)胞遷移實驗和Collagen細(xì)胞侵襲實驗分析發(fā)現(xiàn)，在體外細(xì)胞培養(yǎng)中過表達(dá)Klotho抑制腎癌細(xì)胞的細(xì)胞遷移(cellmigration)和細(xì)胞侵襲(