應(yīng)用力學模型研究腎透明細胞癌微環(huán)境中淋巴細胞與腫瘤生長介導(dǎo)的壓力對腫瘤細胞作用的分子機制.pdf

1、目的：
　　腫瘤微環(huán)境由腫瘤細胞、間質(zhì)細胞及細胞外基質(zhì)共同構(gòu)成，但目前關(guān)于腫瘤微環(huán)境的研究多注重模擬微環(huán)境中生物化學因素，忽略真實體內(nèi)生物力學因素影響，故其結(jié)果的可靠性有待證實。因此，如果能夠利用力學模型加入生物化學因素的刺激，不但能夠進一步模擬體內(nèi)的微環(huán)境，觀察腎透明細胞癌發(fā)生發(fā)展的過程，還將進一步準確揭示生物化學及生物力學因素對腎透明細胞癌轉(zhuǎn)移的分子機制，更主要的是挑戰(zhàn)傳統(tǒng)腫瘤微環(huán)境的觀點限制，為進一步腫瘤治療提出新的觀點和手

2、段。
　　本研究擬借助力學模型構(gòu)建體內(nèi)腫瘤微環(huán)境，研究腎透明細胞癌微環(huán)境中淋巴細胞與腫瘤生長介導(dǎo)的壓力對腫瘤細胞作用的分子機制，本研究旨在為腎透明細胞癌轉(zhuǎn)移及治療尋找新的治療方向，本研究分為以下三部分。
　　方法:
　　1.應(yīng)用PCR Array技術(shù)篩選腫瘤微環(huán)境中關(guān)鍵變化組分以及其對腫瘤細胞的作用
　　通過自行設(shè)計腫瘤微環(huán)境相關(guān)成分PCR Array，篩選正常腎組織與腎腫瘤組織微環(huán)境差異成分CD4;通過免疫組化

3、、臨床隨訪、共聚焦技術(shù)以及腫瘤功能學實驗等進一步篩選關(guān)鍵變化組分;為明確微環(huán)境中影響腎癌進展的關(guān)鍵組分以及進一步可能的機制提供依據(jù)。
　　2.借助力學模型運用基因表達譜技術(shù)篩選生物化學及生物力學聯(lián)合作用下微環(huán)境中促進腎透明細胞癌進展的關(guān)鍵蛋白
　　基于力學模型構(gòu)建腫瘤微環(huán)境模型，運用全基因表達譜技術(shù)驗證生物力學因素對腫瘤影響;在此基礎(chǔ)上，加入微環(huán)境生物化學成分變化因素IL-6，進一步構(gòu)建仿生腫瘤微環(huán)境，再現(xiàn)腎透明細胞癌發(fā)生發(fā)

4、展過程，為后續(xù)微環(huán)境影響腎透明細胞癌進展分子機制提供技術(shù)平臺及理論依據(jù)。
　　3.腫瘤微環(huán)境中促進腎透明細胞癌進展的關(guān)鍵分子及通路驗證性研究
　　應(yīng)用生物力學平臺，驗證基因表達譜芯片篩選出的β-catenin、CD44為代表的關(guān)鍵蛋白在腎透明細胞癌進展中的作用，進一步證實調(diào)控關(guān)鍵蛋白的信號通路，以此為治療腎透明細胞癌提供新的思路及理論基礎(chǔ)。
　　結(jié)果:
　　1.應(yīng)用PCR Array技術(shù)篩選腫瘤微環(huán)境中關(guān)鍵變化組

5、分以及其對腫瘤細胞的作用
　　通過自行設(shè)計的腫瘤微環(huán)境PCR Array，我們對比正常腎組織與腎癌組織發(fā)現(xiàn)微環(huán)境中CD4及上皮間質(zhì)化(epithelial to mesenchymal transition EMT)組分變化明顯;進一步利用免疫組化我們發(fā)現(xiàn)與低級別腎癌相比，高級別中CD4及上皮間質(zhì)化標記物α-SMA表達明顯增高，并且兩者存在正相關(guān)性，因而我們進一步研究兩者在1腎癌中的關(guān)系，體外流式細胞儀提取人原代CD4(+)T細胞

6、與腫瘤細胞共培養(yǎng)，通過ELISA測定培養(yǎng)液中IL-6含量變化顯著增高。然后體外IL-6刺激腎癌腫瘤細胞，通過共聚焦顯像及蛋白水平變化發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞發(fā)生上皮間質(zhì)化現(xiàn)象，并且促進腫瘤細胞的侵襲遷移。為明確微環(huán)境中影響腎癌進展的關(guān)鍵組分以及進一步可能的機制提供依據(jù)。
　　2.借助力學模型運用基因表達譜技術(shù)篩選生物化學及生物力學聯(lián)合作用下微環(huán)境中促進腎透明細胞癌進展的關(guān)鍵蛋白
　　腫瘤微環(huán)境中不僅存在生物化學因素，還有生物力學發(fā)揮作用

7、，我們體外構(gòu)建生物力學微環(huán)境模型，實現(xiàn)力學和化學連續(xù)動態(tài)刺激腫瘤細胞，通過細胞活性及遷移實驗，明確腫瘤細胞微環(huán)境壓力范圍;在此基礎(chǔ)上，我們通過基因表達譜芯片對IL-6刺激組、生物力學刺激組及聯(lián)合作用組進行差異基因的分析定量，同時根據(jù)GO(Gene Ontology)分析挑選出功能與上皮間質(zhì)化及生物力學相關(guān)的分子，在腎癌細胞中進一步篩選出β-catenin關(guān)鍵蛋白，為后續(xù)微環(huán)境影響腎透明細胞癌進展分子機制提供技術(shù)平臺及理論依據(jù)。
　

8、　3.腫瘤微環(huán)境中促進腎透明細胞癌進展的關(guān)鍵蛋白及通路研究
　　選取關(guān)鍵蛋白β-catenin，借助生物力學平臺進行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)β-catenin能有效影響腎癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及細胞于性，而且與腎癌預(yù)后相關(guān)。同時，我們通過全基因表達譜芯片KEGG通路篩選出PI3K-Akt信號通路，基于蛋白水平驗證腫瘤微環(huán)境通過物理化學作用調(diào)控Akt/G SK-3β/β-catenin信號通路影響腎癌進展，以此為治療腎透明細胞癌提供新的思路及理論基礎(chǔ)

9、。
　　結(jié)論:
　　1.本研究成功通過自行設(shè)計的腫瘤微環(huán)境PCR Array，篩選正常腎組織與腎腫瘤組織微環(huán)境差異組分CD4;并且通過免疫組化、臨床隨訪、共聚焦技術(shù)以及腫瘤功能學實驗等進一步篩選出CD4(+)T細胞分泌因子IL-6及其對腫瘤的影響。
　　2.借助生物力學平臺，明確合適的壓力水平促進腫瘤細胞遷移能力增強，利用基因表達譜芯片證明壓力存在仍能進一步加強IL-6作用，使腫瘤細胞惡性程度進一步升高，但是單純的壓力