LGMD分子缺陷分析及基因治療的前期實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肢帶型肌營養(yǎng)不良是一組累及肩胛、骨盆帶和四肢近端肌肉的遺傳性疾病，根據(jù)遺傳模式，可將肢帶型肌營養(yǎng)不良分成常染色體顯性遺傳和隱性遺傳二類共15種類型，這些不同類型的肢帶型肌營養(yǎng)不良雖然在遺傳學(xué)上具高度異質(zhì)性，但臨床表有十分類似之處，給臨床診斷帶來較大困難。 在本研究的第一部分，我們對臨床懷疑為隱性遺傳肢帶型肌營養(yǎng)不良一家系進(jìn)行分析，以明確肌病類型并尋找其致病基因的分子缺陷。連鎖分析時(shí)我們用與8種隱性遺傳性肌營養(yǎng)不良基因連鎖的微衛(wèi)星

2、標(biāo)記進(jìn)行分析；檢測致病基因缺陷時(shí)共用與5種肌營養(yǎng)不良相關(guān)的單克隆抗體作多重免疫印跡分析檢測相應(yīng)致病基因的編碼產(chǎn)物；最后通過RT-PCR擴(kuò)增患者及家屬致病基因的編碼序列并測序確定基因突變。家系連鎖分析顯示在DYSF附近的D2S337位點(diǎn)的Lod score值為1.85，提示致病基因與D2S337連鎖，而這一標(biāo)記位于DYSF基因附近；免疫印跡分析提示先證者DYSF基因的編碼產(chǎn)物dysferlin缺陷；測序證明患者DYSF基因的cDNA第64

3、29位發(fā)生純合性delG突變，這一突變使得dysferlin的合成提前終止。DYSF基因突變可導(dǎo)致LGMD2B或Miyoshil肌病，依據(jù)臨床資料和研究結(jié)果，這一家系中的患者被診斷為Miyoshi肌病,該家系為國內(nèi)首次報(bào)道Miyoshi肌病家系，這一突變?yōu)閲H首次報(bào)道。 在研究另一臨床懷疑為肢帶型肌營養(yǎng)不良散發(fā)病例時(shí)，我們用RT-PCR擴(kuò)增和測序技術(shù)分析calpain3基因的編碼序列和5’端序列是否存在突變。測序結(jié)果顯示患者C

4、APN3基因cDNA第706位發(fā)生雜合性G/A突變，基因的調(diào)控區(qū)序列未見突變。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)人類CAPN3基因在肌肉和外周血存在不同剪切方式，人外周血整個(gè)第15號外顯子被剪切掉，而肌肉組織則保留了第15號外顯子。 目前對肌營養(yǎng)不良這類遺傳性疾病尚無有效治療手段，目前處于研究中的肌母細(xì)胞移植時(shí)細(xì)胞排斥反應(yīng)過強(qiáng)；肌源性干細(xì)胞治療因干細(xì)胞數(shù)量太少而難以應(yīng)用： 而基因治療則仍有應(yīng)用前景。從技術(shù)本身來看，阻斷被治療者體內(nèi)一個(gè)基因的表

5、達(dá)也許比修復(fù)一個(gè)缺陷基因更容易。 Myostatin為TGF-β超家族中新發(fā)現(xiàn)的一員，又稱為轉(zhuǎn)化生長因子-8，是MSTN基因編碼的產(chǎn)物，它也是目前已發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)肌肉生長的負(fù)調(diào)節(jié)因子。有研究顯示MSTN基因被敲除的小鼠的肌纖維數(shù)目明顯增加，肌肉重量比相應(yīng)的野生型小鼠重2～3倍。 在本研究的第二部分我們用較為理想的阻斷基因表達(dá)的siRNA技術(shù)阻斷MSTN基因的表達(dá)，期望通過抑制肌肉生長的負(fù)調(diào)節(jié)因子而使患者的肌肉萎縮與壞死的

6、癥狀得到改善，為此我們構(gòu)建了三個(gè)siRNA表達(dá)載體，并將它們轉(zhuǎn)染到肌母細(xì)胞中，通過實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR、Western blot和細(xì)胞免疫化學(xué)等技術(shù)鑒定siRNA沉默肌母細(xì)胞MSTN基因的效率。實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示我們所構(gòu)建的三個(gè)siRNA表達(dá)載體的干擾率分別為43.6％、47.7％和81.6％，它們的干擾效果也被Western blot所證實(shí)。我們選擇干擾率最高的siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的肌母細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)，觀察MSTN基因被干擾

7、后肌母細(xì)胞的增殖和分化能力。計(jì)數(shù)結(jié)果顯示在相同培養(yǎng)條件下，與對照細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染siRNA表達(dá)載體的肌母細(xì)胞數(shù)目明顯增加，細(xì)胞肌酸激酶活力也明顯升高。形態(tài)學(xué)觀察顯示轉(zhuǎn)染siRNA表達(dá)載體的肌母細(xì)胞在含2％胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)7天細(xì)胞仍未能分化形成肌管，而作為對照的未轉(zhuǎn)染細(xì)胞在7天內(nèi)已開始分化形成肌管。細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察顯示轉(zhuǎn)染siRNA表達(dá)載體的肌母細(xì)胞表面出現(xiàn)大量微絨毛，而對照的未轉(zhuǎn)染細(xì)胞僅出現(xiàn)少量微絨毛。因此肌母細(xì)胞的MS