豬繁殖與呼吸綜合征病毒NSP4切割STAT2分子機制的研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種給全世界的養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失的病毒性傳染病。研究發(fā)現(xiàn)PRRSV通過自身編碼的蛋白抑制機體的天然免疫應答，實現(xiàn)免疫逃避，但目前關于PRRSV編碼的nsp4蛋白抑制JAK-STAT信號通路的分子機制有待進一步研究。
　　本研究通過研究PRRSV編碼的nsp4與JAK-STAT信號通路之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)nsp4能切割關鍵信號分子STAT2。進一步分析了ns

2、p4切割STAT2的氨基酸位點，探討nsp4切割STAT2在PRRSV調控天然免疫反應中的作用。主要內容如下:
　　1.PRRSV感染細胞后抑制ISGs的表達
　　通過相對熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)PRRSV感染PAMs細胞和MARC-145細胞后顯著抑制IFN-α誘導的2'，5'-OAS，ISG15，ISG56和ISG60的mRNA水平;雙熒光素酶實驗結果顯示PRRSV感染MARC-145后可以顯著抑制IFN-α對ISRE-L

3、uc的激活。為篩選出抑制ISRE活性的蛋白，將PRRSV編碼的所有結構蛋白和非結構蛋白的真核表達質粒與熒光素酶報告質粒ISRE-Luc和pGL-4.74共轉染HEK-293T細胞，雙熒光素酶實驗結果顯示PRRSV的非結構蛋白nsp1a、nsp1b、nsp4、nsp11、nsp12，結構蛋白GP3和N均能抑制IFN-α誘導的ISRE啟動子活性，其中nsp4抑制效果顯著。
　　2.PRRSV編碼的nsp4蛋白依賴其絲氨酸蛋白酶活性抑制

4、IFN-α誘導的ISRE活性
　　將真核表達質粒nsp4進行倍比稀釋與熒光素酶報告質粒ISRE-Luc共轉染HEK-293T或3D4細胞，雙熒光素酶檢測結果顯示在這兩種細胞上nsp4均能顯著抑制IFN-α誘導的ISRE啟動子活性，并且呈明顯的劑量依賴;利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)證明nsp4抑制IFN-α誘導的ISRE啟動子活性依賴其絲氨酸蛋白酶活性。
　　3.PRRSV編碼的nsp4蛋白切割STAT2位點為E719
　　本

5、研究發(fā)現(xiàn)超表達nsp4對STAT2蛋白的mRNA水平沒有影響，而切割JAK-STAT信號通路中關鍵蛋白STAT2，且呈明顯的劑量依賴;本研究證明nsp4切割STAT2不依賴泛素-蛋白酶體途徑和細胞凋亡途徑，而是依賴于自身的絲氨酸蛋白酶活性，并鑒定出nsp4切割STAT2的位點為E719。PRRSV感染MARC-145細胞后，Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)內源性STAT2被降解，但是檢測不到切割條帶。
　　4.PRRSV編碼的ns

6、p4蛋白拮抗JAK-STAT信號通路
　　本研究將nsp4真核表達質粒與STAT1和STAT2真核表達質粒共轉染HEK-293T細胞，通過Co-IP實驗發(fā)現(xiàn)PRRSV編碼的nsp4蛋白切割STAT2之后，STAT1和STAT2的相互作用顯著減弱。將STAT2全長或截短突變體與STAT1和IRF9共轉染，雙熒光素酶實驗和熒光定量PCR結果顯示只有全長STAT2可以與STAT1和IRF9作用激活ISRE，誘導ISGs表達，截短的STA

7、T2不能激活ISRE活性和ISGs的表達，nsp4切割STAT2抑制了JAK-STAT信號通路的信號傳遞。
　　綜上所述，本研究首次揭示了PRRSV編碼的nsp4蛋白在拮抗JAK-STAT信號通路中的重要作用;發(fā)現(xiàn)PRRSV編碼的nsp4蛋白依賴其自身的絲氨酸蛋白酶活性切割JAK-STAT信號通路中重要信號分子STAT2蛋白，阻止信號向下游傳遞，抑制ISRE啟動子活性，以及ISGs的轉錄表達。同時鑒定出nsp4切割STAT2的位點