重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(rhBMP-7)對(duì)大鼠心肌梗死后心肌纖維化及左室重構(gòu)的影響和機(jī)制研究.pdf

1、心肌梗死(MI)后發(fā)生心肌纖維化，其主要病理改變?yōu)樾募〖?xì)胞肥大、成纖維細(xì)胞增生、膠原合成異常和過度沉積，可導(dǎo)致心肌僵硬度增加、心室舒張收縮功能減退、電生理紊亂、心律失常、冠狀動(dòng)脈儲(chǔ)備下降，甚至引起猝死。心肌纖維化的機(jī)制較為復(fù)雜，多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子均參與心肌纖維化的發(fā)生和發(fā)展，其中研究最多、作用最明顯的是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)，TGF-β1的表達(dá)與MI后心肌纖維化密切相關(guān)。TGF-β1是一種強(qiáng)效的致纖維化因子，在心肌纖維化

2、時(shí)表達(dá)增加，是目前抗纖維化治療的標(biāo)靶。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(BMP-7)是TGF-β因子超家族的另一成員，研究表明，BMP-7與TGF-β1具有非常相似的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，在纖維化的形成中相互拮抗，共同調(diào)節(jié)纖維化的發(fā)生和發(fā)展。目前國(guó)內(nèi)外尚無BMP-7對(duì)心梗后心肌纖維化的影響及其作用機(jī)制的研究報(bào)道。本研究旨在：(1)探討重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(rhBMP-7)對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞(CFs)增殖和膠原合成的影響及作用機(jī)制；(2)通

3、過腹腔注射rhBMP-7，并與貝那普利進(jìn)行比較，觀察其對(duì)心梗后心肌纖維化及左室重構(gòu)的影響。 一、新生大鼠心肌成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定 目的：在正常心臟，非心肌細(xì)胞約占心臟細(xì)胞總數(shù)的三分之二，其中90％以上是CFs。CFs不僅是膠原分泌的靶細(xì)胞，也是心肌纖維化的效應(yīng)細(xì)胞，在心肌細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)形成和心肌纖維化發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用。TGF-β1是導(dǎo)致心肌纖維化諸多因素最后的共同中介之一，對(duì)心肌成纖維細(xì)胞增殖、分化、遷移

4、和細(xì)胞外基質(zhì)的沉積均有重要的作用。本實(shí)驗(yàn)中，我們通過體外培養(yǎng)新生大鼠CFs，觀察TGF-β1干預(yù)對(duì)CFs增殖的影響，為直接研究相關(guān)細(xì)胞因子與心肌纖維化之間的關(guān)系提供物質(zhì)基礎(chǔ)，為開展藥物對(duì)CFs增殖影響的實(shí)驗(yàn)提供可靠保證。 方法：采用胰酶消化法結(jié)合差速貼壁法培養(yǎng)原代CFs。以第2-3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。通過細(xì)胞形態(tài)觀察和免疫組織化學(xué)染色鑒定CFs的純度；臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活性；噻唑藍(lán)比色法(MTT法)檢測(cè)CFs增殖。 結(jié)果：(

5、1)顯微鏡下觀察可見培養(yǎng)的CFs呈不規(guī)則三角形，胞質(zhì)淡而幾乎透明，折光弱，細(xì)胞核較大，呈橢圓形，通常含2-3個(gè)核，無自發(fā)性搏動(dòng)。臺(tái)盼藍(lán)染色活細(xì)胞數(shù)大于97％。免疫細(xì)胞化學(xué)染色波形蛋白染色呈陽性，血管平滑肌肌動(dòng)蛋白染色呈陰性，PBS對(duì)照呈陰性，符合CFs的染色特征，鑒定為所需的CFs，純度達(dá)98％。(2) MTT法測(cè)定TGF-β1對(duì)CFs增殖的影響，結(jié)果顯示，在1-100ng/ml之間的TGF-β1促進(jìn)了CFs的增生，作用呈濃度依賴性，其

6、中以10ng/ml時(shí)光密度值(OD)最大，與對(duì)照組比較差異十分顯著(P＜0.01)：以10ng/ml濃度的TGF-β1作用于CFs24 h，48h，72h，CFs增殖呈時(shí)間依賴性，48h和72h的OD值最大，與對(duì)照組比較差異十分顯著(P＜0.01)。 結(jié)論：上述結(jié)果顯示，通過胰酶消化結(jié)合差速貼壁法可獲高純度的新生大鼠原代CFs；TGF-β1促進(jìn)CFs增殖呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性，選取10ng/ml、48h作為下一步實(shí)驗(yàn)中TGF-

7、β1的濃度和作用時(shí)間。 二、rhBMP-7對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的新生大鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成的影響及機(jī)制探討 目的：本部分實(shí)驗(yàn)中，我們觀察了不同濃度thBMP-7干預(yù)對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的CFs增殖和膠原合成的影響，以期從細(xì)胞水平上探索thBMP-7是否具有預(yù)防和逆轉(zhuǎn)心肌纖維化的作用；并加入BMP-7下游信號(hào)蛋白Smad5的阻滯劑Jab-1，觀察CFs增殖、膠原合成及下游信號(hào)蛋白表達(dá)的變化情況，探討thBMP-7減輕

8、心肌纖維化的可能機(jī)制。 方法：取第2-3代CFs用于實(shí)驗(yàn)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80％融合時(shí)，吸去原培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，血清饑餓24h后按分組不同分別加入不同刺激因素處理48h:(1)TGF-β1陽性對(duì)照組：TGF-β1(10ng/ml)；(2)rhBMP-7和TGF-β1共處理組：rhBMP-7(1，10，100ng/ml)+TGF-β1(10ng/ml)；(3) rhBMP-7和Jab-1共處理組：Jab-1(20ng/ml)+r

9、hBMP-7(1，10，100ng/ml)+TGF-β1(10ng/ml)。采用MTT法測(cè)CFs生長(zhǎng)數(shù)目，ELISA檢測(cè)Ⅰ、Ⅲ型膠原的含量，Real Time-PCR和Western-Blot分別檢測(cè)Smad2、Smad3、CTGF mRNA和蛋白水平的表達(dá)。 結(jié)果：(1)細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定rhBMP-7對(duì)TGFβ1誘導(dǎo)的CFs增殖的影響，結(jié)果可見：rhBMP-7在濃度為1-100ng/ml范圍內(nèi)可顯著抑制CFs增殖，不同濃度的rh

10、BMP-7組CFs的細(xì)胞計(jì)數(shù)均有不同程度的下降，并隨濃度增加細(xì)胞數(shù)下降更明顯，呈濃度依賴性，100ng/ml濃度組與TGF-β1組相比，差異十分顯著(P<0.01)。用MTT比色法測(cè)定rhBMP-7對(duì)CFs增殖的影響，所獲結(jié)果與細(xì)胞計(jì)數(shù)法一致。(2)細(xì)胞經(jīng)處理48小時(shí)后，不同濃度的rhBMP-7組Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白產(chǎn)量均有不同程度的下降，并隨濃度增加下降更明顯，呈濃度依賴性，與TGF-β1組相比，差異十分顯著顯著(P<0.01)。(3)

11、Real Time-PCR及Westem-Blot結(jié)果顯示，與TGF-β1組相比，rhBMP-7(1-100ng/ml)能濃度依賴性的抑制成纖維細(xì)胞Smad2、Smad3、CTGF mRNA和蛋白的表達(dá)，差異十分顯著(P<0.01)。(4)與rhBMP-7和TGF-β1共處理組相比較，rhBMP-7與Jab-1共處理組的CFsMTT反應(yīng)OD值，Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白含量，Smad2、Smad3、CTGF的mRNA及蛋白表達(dá)均明顯增加，差異十分

12、顯著(P<0.01)。 結(jié)論：(1)rhBMP-7能濃度依賴性地抑制TGF-β1誘導(dǎo)的CFs細(xì)胞的增殖和膠原的合成，抑制CFs細(xì)胞的Smad2、Smad3、CTGF mRNA和蛋白表達(dá)。(2)rhBMP-7可能通過其下游信號(hào)蛋白Smad5來抑制CFs細(xì)胞的增殖和膠原的合成。 三、rhBMP-7對(duì)大鼠心肌梗死后心肌纖維化及左室重構(gòu)的影響 目的：通過腹腔注射rhBMP-7，觀察其對(duì)心梗后心肌纖維化及左室重構(gòu)的影響，進(jìn)

13、一步明確rhBMP-7在體內(nèi)的抗纖維化作用。 方法：對(duì)SD大鼠建立急性心肌梗死(AMI)模型，將術(shù)后存活的60只大鼠分為以下各組；12只為假手術(shù)組(Sham組，開胸后僅在大鼠心臟左冠狀動(dòng)脈處穿線，不結(jié)扎冠脈，自術(shù)后第2天起，給予腹腔注射生理鹽水1ml，隔天一次，共28天)；余48只隨機(jī)分為MI組(n=12，自術(shù)后第2天起，給予腹腔注射生理鹽水1ml，隔天一次，共28天)、治療組(n=36分為BMPA、BMPB、Ben三組，每組各

14、12只，自術(shù)后第2天起，分別給予rhBMP-780ug.320ug每公斤體重隔日一次腹腔注射及貝那普利10mg每公斤體重每日灌胃，用藥時(shí)間共28天)。每組各取6只分別于術(shù)后14、28天處死。HE染色觀察大鼠心肌組織損傷的情況；Masson染色觀察膠原改變情況，計(jì)算左室心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF，％)和血管周圍膠原面積( PVCA，％)；ELISA檢測(cè)心肌羥脯氨酸(Hyp)、血清Ⅰ型前膠原羧基端肽(PICP)及Ⅲ型前膠原氨基端肽(PIIIN

15、P)含量；免疫組化檢測(cè)MMP-9、TIMP-2表達(dá)情況；Real Time-PCR和Western-Blot檢測(cè)BMP-7、TGF-β1、Smad2、Smad3和CTGF mRNA、蛋白的表達(dá)情況；超聲多普勒評(píng)定左室重構(gòu)和心功能。 結(jié)果：(1) thBMP-7能降低大鼠心梗后CVF和PVCA的水平，BMPA組與Ben組無明顯差異，BMPB組較BMPA組及Ben組降低得更為明顯，有明顯差異(P<0.05)；(2) thBMP-7明

16、顯減少心肌Hyp、PICP及PIIINP的含量，療效呈劑量依賴性，BMPA組與Ben組無明顯差異，BMPB組優(yōu)于BMPA組和Ben組，有明顯差異(P<0.05)；(3)rhBMP-7明顯減少M(fèi)MP-9的表達(dá)，減少M(fèi)MP-9/TIMP-2的比值，BMPA組與Ben組無明顯差異，BMPB組優(yōu)于BMPA組和Ben組，有明顯差異(P<0.05)；(4) thBMP-7可改善左室收縮、舒張功能，逆轉(zhuǎn)左室重構(gòu)，BMPA組與Ben組之間無明顯差異，B