卵巢惡性腫瘤患者Th2優(yōu)勢(shì)狀態(tài)及其逆轉(zhuǎn)研究.pdf

1、目的:1.建立并優(yōu)化細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子mRNA的檢測(cè)方法.2.檢測(cè)卵巢惡性腫瘤患者Th1/Th2細(xì)胞因子及其相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)狀況.3.探討川芎嗪在體外對(duì)卵巢惡性腫瘤患者Th2優(yōu)勢(shì)狀態(tài)的逆轉(zhuǎn)作用.方法:1.建立RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的方法 貼壁培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞株HO-8910;Ficoll分離外周血單個(gè)核細(xì)胞;異硫氰酸胍一步法提取總RNA.RT反應(yīng)條件為:37℃、1h;70℃滅活15min.PCR體系反應(yīng)條件:94℃變性

2、45s,58℃退火45s,72℃延伸,進(jìn)行30個(gè)循環(huán).1％的瓊脂糖,加樣PCR產(chǎn)物總量為8μl,90V電流100A電泳20min.對(duì)引物、Taq酶、MgCl<,2>的終濃度進(jìn)行梯度試驗(yàn),擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳,分析結(jié)果,選擇最優(yōu)體系.運(yùn)用優(yōu)化后的PCR體系,檢測(cè)卵巢惡性腫瘤患者PBMCs細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá).2.卵巢惡性腫瘤患者免疫狀態(tài)的研究 研究組為44例卵巢惡性腫瘤患者,對(duì)照組為10名健康女性,分離PBMCs,提取總RNA,RT-

3、PCR擴(kuò)增目的基因,產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳.以β-actin為內(nèi)參照,半定量分析各細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)強(qiáng)度.所有結(jié)果運(yùn)用確切概率法、t檢驗(yàn)和直線相關(guān)分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理.3.川芎嗪逆轉(zhuǎn)卵巢惡性腫瘤免疫逃逸狀態(tài)的體外研究 20例卵巢惡性腫瘤患者,分離其PBMCs;并以細(xì)胞濃度2×106/ml進(jìn)行體外培養(yǎng);按100μg/ml加入川芎嗪,37℃、5%CO<,2>培養(yǎng)48h,RT-PCR方法檢測(cè)川芎嗪作用前后細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平,半定量分析各

4、因子的表達(dá)強(qiáng)度.4.熒光定量PCR方法的建立及初步運(yùn)用 卵巢癌細(xì)胞株HO-8910培養(yǎng);卵巢惡性腫瘤患者PBMCs分離;提取總RNA后進(jìn)行RT反應(yīng).以染料SYBR GreenⅠ作為熒光標(biāo)記進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng);在55~95℃的區(qū)間內(nèi)繪制熒光定量PCR產(chǎn)物溶解曲線;各因子定量以Ct值為標(biāo)準(zhǔn),與該組的內(nèi)參照β-actin的Ct值比較,獲得細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的基因豐度比.凝膠電泳對(duì)熒光定量PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢驗(yàn).結(jié)論:1.RT-PCR和FQ-P