68Ga標(biāo)記NGR肽的腫瘤血管生成顯像研究.pdf

1、背景:
　　正電子發(fā)射顯像(Positron Emission Tomography,PET)已經(jīng)成為核醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的主導(dǎo)成像方法之一。目前臨床常用的正電子核素均依賴(lài)于回旋加速器生產(chǎn),最常使用的18FDG并非腫瘤特異性靶向顯像劑,進(jìn)展中的抗腫瘤靶向治療和個(gè)體化治療準(zhǔn)則對(duì)腫瘤特異性靶向顯像劑提出了更高的要求。68Ge/68Ga發(fā)生器生產(chǎn)的正電子核素制備靶向特異性PET探針是對(duì)臨床18FDG顯像的重要補(bǔ)充。該發(fā)生器是發(fā)展最成熟的正電子發(fā)生

2、器,68Ga的半衰期和正電子豐度特別適宜標(biāo)記肽類(lèi)等小分子物質(zhì)用于PET顯像。血管生成是抗癌治療研究和腫瘤影像的非常有吸引力的靶點(diǎn)。APN/CD13在腫瘤血管生成中起到了重要作用,含有NGR基序的肽可以與腫瘤新生血管高表達(dá)的CD13特異靶向結(jié)合。構(gòu)建靶向CD13的68Ga標(biāo)記NGR肽,用有望用于CD13陽(yáng)性的腫瘤血管生成顯像并指導(dǎo)腫瘤抗血管生成靶向治療。
　　目的:
　　1、以CD13為靶點(diǎn),合成新的雙功能螯合劑NOTA聯(lián)接的

3、NGR環(huán)肽單體和二聚體,并用68Ga標(biāo)記,為靶向腫瘤血管生成的PET顯像提供新的方法。通過(guò)肽結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì),改善前期工作中存在的肝臟高攝取現(xiàn)象。
　　2、建立本實(shí)驗(yàn)室條件下68Ga標(biāo)記肽的最優(yōu)化條件和流程,為今后的標(biāo)記工作和發(fā)展自動(dòng)化標(biāo)記奠定基礎(chǔ)。
　　3、評(píng)估68Ga-NOTA-G3-NGR、68Ga-NOTA-G3-NGR2和68Ga-NOTA-G3-RGD2的體外性質(zhì),以及HT1080荷瘤鼠MicroPET顯像效應(yīng)及體內(nèi)生物

4、學(xué)分布。分別比較68Ga-NOTA-G3-NGR和68Ga-NOTA-G3-NGR2以及68Ga-NOTA-G3-NGR2和68Ga-NOTA-G3-RGD2兩兩之間的體外性質(zhì)及 MicroPET顯像效應(yīng)的差異,為共表達(dá)CD13和整合素αvβ3的腫瘤靶向影像及靶向治療的靶點(diǎn)和探針選擇提供依據(jù)。
　　方法:
　　1、采用二硫鍵方式形成環(huán)化NGR肽;采用含有獨(dú)立結(jié)合基團(tuán)p-SCN-Bz的p-SCN-Bz-NOTA做為雙功能螯合劑

5、,有利于保留NOTA固有的結(jié)合空間和配位能力;選用G3修飾鏈增加兩個(gè)CNGRC之間的鍵長(zhǎng),改善與受體結(jié)合能力及體內(nèi)排泄動(dòng)力;p-SCN-Bz-NOTA與NGR肽的聯(lián)接采用穩(wěn)定的硫脲鍵結(jié)合。
　　2、通過(guò)淋洗效率測(cè)定、確定分段淋洗法選取的淋洗區(qū)間。用分段淋洗法確定標(biāo)記反應(yīng)的最佳條件:pH、溫度、反應(yīng)時(shí)間和肽量,使用SCX柱和C18柱純化標(biāo)記產(chǎn)物,選取最佳純化方法。在確立的最佳反應(yīng)條件下用68Ga標(biāo)記NGR肽和RGD肽,通過(guò)測(cè)定標(biāo)記率

6、和放化純度,進(jìn)一步確定反應(yīng)條件的最優(yōu)化。
　　3、測(cè)定所標(biāo)記探針的脂水分配系數(shù)(logP)、體外穩(wěn)定性、探針的細(xì)胞攝取和流出以及受體競(jìng)爭(zhēng)抑制的IC50值,評(píng)斷探針的體外性質(zhì)。
　　4、標(biāo)記探針對(duì)HT1080荷瘤鼠和HT29荷瘤鼠行MicroPET顯像,并行未標(biāo)記冷肽抑制實(shí)驗(yàn),用ROI定量分析腫瘤和重要器官攝取情況,對(duì)比合成的NGR肽單體和二聚體之間、NGR肽二聚體和RGD肽二聚體之間的差異情況。并分別測(cè)定荷瘤鼠體內(nèi)標(biāo)記探針的

7、生物分布情況一同進(jìn)行比較。
　　結(jié)果:
　　1、經(jīng)質(zhì)譜分析證實(shí)成功合成了NOTA-G3-cCNGRC單體和二聚體。
　　2、用分段淋洗法確定了68Ga標(biāo)記NOTA-G3-cCNGRC單體和二聚體的最佳反應(yīng)條件為pH3.0-3.5,42℃,10 min,15-20μg肽。明確了對(duì)于68Ga標(biāo)記肽的純化即可采用C18柱,也可采用SCX柱。SCX柱洗脫效率高,稀釋后可直接使用。C18柱純化后含有乙醇,有時(shí)需做進(jìn)一步處理。

8、r>　　3、68Ga-NOTA-G3-NGR、68Ga-NOTA-G3-NGR2和68Ga-NOTA-G3-RGD2均為親水性探針,體外穩(wěn)定性良好,體外實(shí)驗(yàn)顯示良好受體結(jié)合特異性,三種探針均能使HT1080腫瘤清晰顯像,腫瘤攝取能被未標(biāo)記冷肽抑制,具備高靶向特異性和高的T/NT值。均經(jīng)泌尿系統(tǒng)快速排泄,血液清除快,肝臟等重要器官攝取值低,有利于向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化。
　　4、PET定量分析及體內(nèi)生物分布檢測(cè)顯示68Ga-NOTA-G3-

9、NGR和68Ga-NOTA-G3-NGR2兩種探針的腫瘤攝取及體內(nèi)分布情況無(wú)顯著差異;68Ga-NOTA-G3-NGR2和68Ga-NOTA-G3-RGD2兩種探針的腫瘤攝取及體內(nèi)分布情況無(wú)顯著差異。
　　結(jié)論:
　　1、本研究成功合成了靶向CD13的NOTA聯(lián)接的NGR環(huán)肽單體和二聚體。用分段淋洗發(fā)生器法確定了68Ga標(biāo)記NOTA-G3-NGR的最適宜條件是pH3.0-3.5,42℃,10 min,15-20μg肽,確立了

10、本實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化的68Ga標(biāo)記肽的新方法。
　　2、新合成的68Ga-NOTA-G3-NGR和68Ga-NOTA-G3-NGR2都是適用于CD13陽(yáng)性腫瘤血管生成顯像的新型探針,也是目前報(bào)道的第一組68Ga標(biāo)記NGR環(huán)肽探針。二者在HT1080腫瘤血管生成顯像中具有同等效力,并且改變了前期工作中NGR肽探針的肝臟高攝取。
　　3、68Ga-NOTA-G3-RGD2和68Ga-NOTA-G3-NGR2對(duì)共表達(dá)CD13和αvβ3整合