潰瘍性結(jié)腸炎患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能狀態(tài)的研究.pdf

1、炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一組累及胃腸道的自身免疫性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎(uclerative colitis，UC)和Crohn病(Crohn’s disease，CD)。近年來，炎癥性腸病(IBD)尤其是潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。其病因、發(fā)病機(jī)制目前仍不明確，認(rèn)為與免疫、環(huán)境、感染及遺傳等多種因素相互作用有關(guān)，其中免疫因素在IBD發(fā)病中起著重要作用，且已成為研究熱點(diǎn)。

2、 炎癥性腸病由過強(qiáng)的免疫反應(yīng)所介導(dǎo)，T淋巴細(xì)胞在其中起重要作用，但T胞介導(dǎo)的免疫失耐受機(jī)制不很清楚。機(jī)體內(nèi)存在以抑制免疫反應(yīng)為主要功能特點(diǎn)的較獨(dú)立的CD4+T淋巴細(xì)胞亞群(現(xiàn)傾向于稱為調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞，Treg)，其中CD4+CD25+T細(xì)胞是目前所認(rèn)識(shí)的最重要的一群，調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞/致病性T淋巴細(xì)胞平衡是機(jī)體調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的重要模式之一，其紊亂可能是很多自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制[1]。過強(qiáng)的免疫反應(yīng)可由致病性T細(xì)胞(促炎促免疫T細(xì)

3、胞)原發(fā)性功能增強(qiáng)引起，也可能由調(diào)節(jié)性T細(xì)胞免疫抑制功能原發(fā)性下降所引起。研究調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在病人機(jī)體內(nèi)的功能狀態(tài)，回答炎癥性腸病的發(fā)病是否與調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的抗原特異性免疫抑制功能缺陷有關(guān)是值得嘗試的[2]。 從正常人和UC患者外周血中收集并分離淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，用自體腸道菌群制作成抗原，在體外培養(yǎng)中刺激淋巴細(xì)胞，然后檢測(cè)代表調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表型CD25、CD152、CD45RB(CD45RO)，轉(zhuǎn)錄因子FOXP3，以及細(xì)胞因子

4、IL-6、TNF-α、IL-10、IFN-γ和IL-4等，能夠初步的評(píng)介出調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的在UC中的數(shù)量及功能狀態(tài)。 材料與方法： 一、材料：研究對(duì)象均來源于于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院內(nèi)鏡中心做電子腸鏡檢查者。對(duì)照組15例，男8例，女7例，年齡20-57歲，平均36歲；潰瘍性結(jié)腸炎(UC)組23例，男14例，女9例，年齡16-55歲，平均33歲。 二、主要試劑及儀器：Human Regulatory T Cell St

5、aining Kit，CD4(7E14)-FITC/CD25(1TYV)-PE Cocktail，抗人CD45RO(UCHL1)/Biotin和CD152/Biotin，ELISA Kit，考馬斯亮藍(lán)總蛋白定量試劑等。流式細(xì)胞儀、低速低溫離心機(jī)、CO2孵箱、超聲細(xì)胞破碎儀、酶標(biāo)儀、可見光分光光度計(jì)等三、淋巴/單核細(xì)胞分離：用肝素抗凝管采外周血10mL，10min內(nèi)用RPMI1640(含10mmol/LHEPES，100kU/L青霉素、3

6、0mg/L慶大霉素)10mL稀釋后加入2個(gè)15mL離心管，用連接6號(hào)加長(zhǎng)針頭的注射器抽L(zhǎng)ympholyte-H(1.077 kg/L)，每管4mL緩慢加在稀釋血液下面，1200r/min離心20min，取灰白層單個(gè)核細(xì)胞懸液，PBS洗2次，用5mL RPMI1640(含100mL/L胎牛血清，HEPES及雙抗)混懸細(xì)胞，將低密度Percoll(1.068kg/mL，335mmol/L)4mL和高密度Percoll(1.080 kg/mL

7、，335mmol/L)2mL分層鋪在細(xì)胞懸液下面，2000 r/min離心15min，取低密度Percoll中段以上及至高密度Percoll中段的細(xì)胞懸液，分別作為單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，PBS洗2次，苔盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞均在96％以上，取細(xì)胞懸液作離心涂片，Wrights-Giemsa染色鑒定，淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的純度分別在97％和90％以上。 四、腸道菌群抗原的制作：腸鏡下取大腸標(biāo)本，將其表面所帶細(xì)菌接種到50ml皰肉培養(yǎng)基中，

8、液體石蠟封閉，37℃培養(yǎng)48小時(shí)，離心、超聲破碎及考馬斯亮藍(lán)法測(cè)細(xì)菌抗原總蛋白濃度。 五、細(xì)胞培養(yǎng)：培養(yǎng)基為約含10％自身血漿的RPMI-1640，濾除去血小板，用含雙抗(100u/ml青霉素+30ug/ml慶大霉素)、10mM HEPES及0.05mM β-ME的RPMI-1640稀釋后作為完全培養(yǎng)基。單核細(xì)胞以1×105個(gè)/孔加入96孔板，并以20ug/ml加入自身來源的腸道厭氧菌群抗原，對(duì)照孔不加細(xì)菌抗原，16小時(shí)后每隔2

9、小時(shí)半量換液一次，共4次，以稀釋除去細(xì)菌抗原，然后按8×104/孔加入自身的淋巴細(xì)胞，隔天半量換液一次。 六、流式細(xì)胞術(shù)：分離第2天及混合培養(yǎng)第14天的淋巴細(xì)胞用于流式細(xì)胞檢測(cè)CD4、CD25、CD45RO、CD152及FOXP3的表達(dá)，操作按照試劑盒說明。 七、ELISA：培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子IL-6、TNF-α、IL-10、IFN-γ和IL-4的濃度用ELISA檢測(cè)，按照說明操作。 八、統(tǒng)計(jì)分析：所有數(shù)據(jù)均用

10、Mean±SD表示，計(jì)算用SPSS11.5完成，比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，P<0.05和P<0.01被認(rèn)為分別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義和顯著意。 結(jié)果： 一、淋巴／單核細(xì)胞的分離效果及鑒定 淋巴和單核細(xì)胞計(jì)數(shù)在96％以上，淋巴細(xì)胞的純度為95％以上，單核細(xì)胞的純度在85％以上，從12ml人外周血中分離出1.23±0.33x107個(gè)淋巴細(xì)胞和1.76±0.71x106個(gè)單核細(xì)胞。 二、未刺激淋巴細(xì)胞CD4、CD25和

11、FOXP3的表達(dá) 外周血淋巴細(xì)胞CD4、CD25、CD25hi、FOXP3的表達(dá)在對(duì)照組和潰瘍性結(jié)腸炎組間無明顯差別。約60％的CD25+細(xì)胞同時(shí)表達(dá)FOXP3，85％的CD25hi細(xì)胞同時(shí)表達(dá)FOXP3。無論在對(duì)照組還是UC組，CD25hi和FOXP3的表達(dá)具有非常顯著的相關(guān)性(P<0.001)。 三、未刺激淋巴細(xì)胞CD4、CD25、CD45RO、CD152的表達(dá) 約91％的CD4+CD25+T細(xì)胞同時(shí)表達(dá)CD

12、45R0，CD152在CD4+T細(xì)胞膜表面很少表達(dá)(約占1％)。對(duì)照組與UC組新鮮分離外周血淋巴細(xì)胞在CD45R0和CD152的表達(dá)上沒有顯著差別。 四、淋巴細(xì)胞在體外培養(yǎng)中經(jīng)自身腸道菌群抗原刺激后，細(xì)胞總數(shù)均增加(與未刺激比較，對(duì)照組和UC組分別平均增加21％和52％，均P<0.001)。 CD4+T細(xì)胞的比例在對(duì)照組和UC組均明顯上升(P<0.001)，而FOXP3+、CD25+FOXP3+及CD25hiFOXP3+

13、T細(xì)胞的比例變化不大。值得注意的是，無論CD4+CD25+FOXP3+T細(xì)胞占CD4+CD25+T細(xì)胞的比例，還是CD4+CD25hiFOXP3+T細(xì)胞占CD4+CD25hi T細(xì)胞的比例，在兩組的所有研究對(duì)象中均呈下降趨勢(shì)(均P<0.05)。 五、潰瘍性結(jié)腸炎組外周血淋巴細(xì)胞對(duì)自身腸道菌群抗原體外刺激的增殖比對(duì)照組高(P<0.001)，CD25+ 或 CD25hi T 細(xì)胞中FOXP3+細(xì)胞的比例在刺激后UC組明顯低于對(duì)照組(

14、40.18％vs52.3％或53.90％vs 77.85％，均P<0.001)。 六、外周血淋巴細(xì)胞與自身腸道厭氧菌群抗原刺激的單核細(xì)胞混合培養(yǎng)后，由單核細(xì)胞表達(dá)的IL-6和TNF-α在UC組明顯高于對(duì)照組(P<0.01)。 結(jié)論： 1、外周血中淋巴細(xì)胞CD4、CD25、CD25hi、FOXP3及CD45R0和CD152的表達(dá)上，在對(duì)照組和潰瘍性結(jié)腸炎組組間無明顯差別，UC患者外周血中CD4+CD25+Treg保

15、持了他們的抑制活性。 2、對(duì)照組和UC組外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞中，CD25hi和FOXP3的表達(dá)具有非常顯著的相關(guān)性，F(xiàn)OXP3是CD4+CD25+Treg細(xì)胞的特異性分子標(biāo)記物，對(duì)CD4+CD25+Treg發(fā)揮功能是必需的，是Treg發(fā)育的一個(gè)重要開關(guān)。 3、所有研究對(duì)象的淋巴細(xì)胞在體外培養(yǎng)中，經(jīng)自身腸道菌群抗原刺激后，細(xì)胞總數(shù)均增加，活化增殖的細(xì)胞中主要是CD4+CD25+FOXP3-反應(yīng)性T細(xì)胞，而不