殼聚糖納米載體對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)影響的研究.pdf

1、目的：目前關(guān)于無機(jī)納米粒的毒性研究很多，而關(guān)于有機(jī)可降解納米載體的毒性研究很少。殼聚糖納米粒作為載體在腦部疾病治療中應(yīng)用廣泛，并且常用吐溫80修飾用于促進(jìn)腦部遞藥，然而罕有關(guān)于其安全性的研究。本研究對(duì)殼聚糖納米粒、吐溫80修飾殼聚糖納米粒對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的影響進(jìn)行了研究。
　　方法：⑴通過離子凝膠化法制備殼聚糖納米粒（CS-NPs）、吐溫80修飾殼聚糖納米粒(TmCS-NPs)，并對(duì)其粒徑、電位、形態(tài)進(jìn)行了表征；⑵在SD大鼠上評(píng)價(jià)兩種納

2、米粒的神經(jīng)毒性，首先采用羅丹明B異硫氰酸酯（RBITC）對(duì)殼聚糖進(jìn)行熒光標(biāo)記，制備熒光標(biāo)記的CS-NPs、TmCS-NPs，觀察熒光標(biāo)記的納米粒在大鼠腦部分布，而后連續(xù)七天尾靜脈注射高(30mg/kg)、中(10mg/kg)、低（3mg/kg）劑量納米混懸液，并對(duì)主要聚集腦區(qū)的氧化應(yīng)激標(biāo)志物水平、組織病理學(xué)變化及GFAP、NeuN的表達(dá)進(jìn)行了檢測，此外，還對(duì)大鼠體重變化情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；⑶在斑馬魚胚胎模型上評(píng)價(jià)CS-NPs、TmCS-NPs

3、的發(fā)育神經(jīng)毒性，首先將胚胎暴露于一系列濃度梯度(5mg/L，10mg/L，20mg/L，30mg/L，40mg/L，50mg/L) CS-NPs、TmCS-NPs混懸液，統(tǒng)計(jì)各組胚胎死亡率、孵化率及畸形發(fā)生情況，并計(jì)算兩種納米粒的LC50，以1/2 LC50作為暴毒濃度對(duì)CS-NPs、TmCS-NPs暴露后胚胎神經(jīng)行為及相關(guān)機(jī)制進(jìn)行研究，神經(jīng)行為評(píng)價(jià)指標(biāo)包括19～27hpf胚胎自主運(yùn)動(dòng)、72hpf幼魚機(jī)械觸碰逃避反應(yīng)、120hpf幼魚自

4、由游泳活力及光暗周期反應(yīng)活力測定，機(jī)制研究包括胚胎活性氧檢測、流式細(xì)胞術(shù)測定凋亡、吖啶橙染色評(píng)價(jià)凋亡、蘇木精-伊紅染色、透射電鏡觀察幼魚肌肉形態(tài)、整體胚胎免疫組化染色評(píng)價(jià)初級(jí)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和次級(jí)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突的發(fā)育。
　　結(jié)果：離子凝膠化法制備的CS-NPs、TmCS-NPs平均粒徑分別為247±20 nm、251±15 nm，制備的納米粒粒徑均一，形態(tài)圓整，zeta電位分別為24.4±3.9 mV、26.5±4.2 mV。利用RBI

5、TC對(duì)殼聚糖進(jìn)行熒光標(biāo)記，本研究觀察了250 nm左右CS-NPs、TmCS-NPs在大鼠體內(nèi)分布情況，檢測到TmCS-NPs在腦部的熒光信號(hào)，而未檢測到CS-NPs在腦部的熒光信號(hào)，250 nm左右TmCS-NPs主要分布在大鼠的大腦皮層和小腦。連續(xù)七天尾靜脈注射TmCS-NPs后，大腦皮層、小腦的氧化應(yīng)激反應(yīng)均不明顯，但與空白對(duì)照組相比，大鼠體重降低明顯，且呈劑量依賴。此外，TmCS-NPs處理后，皮層局部區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)變?yōu)樗笮危?/p>

6、且隨著TmCS-NPs注射劑量的增高，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)變化越明顯。TmCS-NPs暴露還導(dǎo)致小腦GFAP表達(dá)降低。這些現(xiàn)象都表明TmCS-NPs具有潛在神經(jīng)毒性。進(jìn)一步在斑馬魚胚胎模型上對(duì)CS-NPs、TmCS-NPs的發(fā)育神經(jīng)毒性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。斑馬魚胚胎暴露于一系列濃度梯度CS-NPs、TmCS-NPs混懸液后，胚胎死亡率增加、孵化率降低，且呈劑量依賴。CS-NPs、TmCS-NPs在胚胎上的LC50分別為23.26mg/L、25.06mg

7、/L。CS-NPs、TmCS-NPs暴露后，觀察到幼魚發(fā)生游囊關(guān)閉及脊椎彎曲，隨著濃度的升高，畸形發(fā)生率增加。在相對(duì)安全的濃度(1/2 LC50)下，納米粒暴露可引起胚胎運(yùn)動(dòng)行為的紊亂:TmCS-NPs暴露降低了20hpf、21hpf時(shí)胚胎的自主運(yùn)動(dòng)頻率;CS-NPs、TmCS-NPs暴露降低了72hpf時(shí)幼魚的機(jī)械觸碰逃避反應(yīng);CS-NPs暴露增加了120hpf時(shí)光周期試驗(yàn)中黑暗周期幼魚的運(yùn)動(dòng)活力。
　　結(jié)論：CS-NPs、Tm