吸煙者血清microRNA異常表達及與肺癌變的關系.pdf

1、目的：肺癌是世界上發(fā)病率、死亡率最高的惡性腫瘤之一，嚴重危害人類生命和健康。近年來盡管肺癌的臨床診斷技術與治療技術不斷改進與提高，但依然因缺乏有效的肺癌早期診斷方法，臨床上僅有20-25％的非小細胞肺癌可獲得早期診斷，導致肺癌死亡率一直持續(xù)穩(wěn)定在85%的高水平。眾多流行病學研究資料表明吸煙是誘發(fā)肺癌的首要危險因素，香煙煙霧中含有多種與肺癌關系密切的化學致癌物質(zhì)或誘變劑。這些物質(zhì)可通過氧化應激、DNA損傷等不同機制，引起支氣管上皮細胞損害

2、、癌基因激活、抑癌基因突變和失活等導致細胞遺傳信息轉(zhuǎn)化而發(fā)生癌變。近年來隨著miRNA的不斷深入研究，人們發(fā)現(xiàn)miRNA不僅廣泛參與細胞增殖、分化、凋亡、上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型、組織器官形成和生長發(fā)育等正常生理過程，也廣泛參與各種疾病的發(fā)生、發(fā)展過程，特別與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等病理過程關系密切。眾多有關肺癌的miRNA研究結果提示，miRNA不僅可做為肺癌早期診斷的分子生物標記物，同時也可做為肺癌治療的分子靶標而用于肺癌的治療，以及肺

3、癌治療效果的預后評估。近五年來有關香煙暴露與miRNA的研究表明，香煙煙霧可誘發(fā)人和鼠肺、肝等組織的miRNA表達變化。因此通過香煙暴露誘發(fā)miRNA表達變化與肺癌之間關系的研究，將有助于深入了解香煙暴露致肺癌發(fā)生的分子作用機制。但限于健康吸煙人肺組織標本的獲取困難，臨床上難以通過獲取正常吸煙人肺組織進行連續(xù)的觀察。而近年來隨著循環(huán)miRNA的研究發(fā)現(xiàn)，循環(huán)miRNA具有良好的微侵襲性、高度組織特異性、穩(wěn)定性等特點，可能是腫瘤早期診斷的

4、理想分子生物標記物和腫瘤治療的靶標。鑒于循環(huán)miRNA的這些優(yōu)點，我們將通過研究血清miRNA在正常人群、吸煙人群和肺癌人群間的表達變化，闡明香煙暴露條件下血清miRNA表達水平變化與肺癌血清miRNA之間關系；其次分析比較血清特異性的miRNA表達變化與肺癌病理類型、吸煙指數(shù)之間的劑量效應關系；最后通過吸煙誘導特異性改變的miRNA作用的靶基因和信號通路預測，了解吸煙誘導肺癌變過程中血清miRNA可能參與的作用機制。
　　方法：

5、①吸煙與肺癌患者血清microRNA差異性表達研究。胸部CT等影像學檢查初步診斷為肺癌，未經(jīng)過手術治療、放射治療或化學治療的男性患者，經(jīng)術后病理診斷為非小細胞肺癌者入選為肺癌組（84例）。健康體檢的男性人群進行吸煙問卷調(diào)查，入選健康吸煙組100例，入選健康不吸煙組49例。采集、分離獲得各組入選對象的空腹血清。選取肺癌組中肺腺癌和肺鱗癌血清樣品各5例、健康吸煙組和健康不吸煙組血清樣品各10例。將三組中的10例血清樣品等體積混合后，分別抽提

6、三組混合樣品的RNA。采用Exiqon的miRCURYTM LNA Array(v.16.0)進行基因表達譜檢測，獲取各組miRNA表達譜，分別比較各組間miRNA表達譜的差異性。②吸煙者血清let-7i-3p、miR-154-5p差異性表達及與肺癌變的關系。分別選取健康不吸煙組、健康吸煙組和肺癌組各30例樣品，對芯片結果顯示呈三倍及以上差異表達的miR-7-5p，miR-502-3p，miR-200c-5p， miR-1301， mi

7、R-129-2-3p、let-7i-3p、miR-196a-3p和miR-154-5p等8個miRNA進行實時定量PCR驗證。驗證后選取顯著下調(diào)表達的let-7i-3p和miR-154-5p兩個miRNA，分別增加健康不吸煙組、吸煙組、肺癌組標本例數(shù)進行實時定量PCR檢測，并結合肺癌的病理類型、吸煙指數(shù)變化，分析比較三組間let-7i-3p和miR-154-5p表達水平與肺癌病理類型、吸煙指數(shù)變化的關系。通過mirbas、miranda

8、和targetscan三個數(shù)據(jù)庫對let-7i-3p和miR-154-5p進行靶基因預測，通過KEGG pathways對預測的靶基因進行信號通路的預測分析，通過靶基因和信號通路的預測了解let-7i-3p和miR-154-5p在吸煙在肺癌變過程中的意義。
　　結果：⑴miRNA芯片表達譜結果顯示，健康不吸煙組、健康吸煙組和肺癌三組血清樣品中448個miRNA顯示有陽性信號，用于進一步的數(shù)據(jù)分析表達。其中健康吸煙組與健康不吸煙組比

9、較有105個miRNA呈三倍及以上差異性表達，其中上調(diào)和下調(diào)表達的miRNA分別為32個、75個。肺癌組與健康不吸煙組比較有163個miRNA呈三倍及以上差異性表達，其中上調(diào)和下調(diào)表達的miRNA分別為74個、89個。兩組血清miRNA表達與相關文獻報道的肺癌組織中miRNA表達譜變化相似，均以miRNA下調(diào)表達為主。⑵在健康吸煙組與健康不吸煙組、肺癌組與健康不吸煙組比較中，兩者之間呈相同表達變化的miRNA有85個，分別占健康吸煙組與

10、健康不吸煙組差異表達 miRNA的80.95%（85/105）和肺癌組與健康不吸煙組的52.15%（85/163）。而肺癌組與健康不吸煙組、肺癌與吸煙組比較中，兩者間呈相同差異性表達的比率分別為16.56%（27/163）、36.98%（27/73）。三組間相互比較的結果表明健康吸煙與肺癌患者血清miRNA表達譜改變高度類似。觀察健康吸煙組與健康不吸煙組、肺癌組與健康不吸煙組中呈相同三倍及以上差異性表達的miRNA，均未發(fā)現(xiàn)在健康吸煙組

11、與健康不吸煙組、肺癌組與健康不吸煙組中存在相反表達的miRNA。提示肺癌血清的miRNA表達改變可能是吸煙誘導血清持續(xù)改表的結果。⑶根據(jù)miRNA芯片結果選取 miR-7-5p，miR-502-3p，miR-200c-5p，miR-1301， miR-129-2-3p、let-7i-3p、miR-196a-3p和miR-154-5p等miRNA進行初步驗證，結果發(fā)現(xiàn)，let-7i-3p和miR-154-5p在健康吸煙組與健康不吸煙組、肺

12、癌組與健康不吸煙組比較中，呈顯著下調(diào)表達。增加三組的樣品量進一步證實，與健康不吸煙組相比，let-7i-3p、miR-154-5p在健康吸煙組和肺癌組中均呈下調(diào)表達，差異均有統(tǒng)計學意義。2. let-7i-3p相對表達水平與肺癌的病理類相關。與健康不吸煙組和健康吸煙組比較， let-7i-3p在肺鱗癌組中表達下調(diào)，有統(tǒng)計學意義； let-7i-3p在肺腺癌組中表達無統(tǒng)計學差異。⑷miR-154-5p相對表達水平在不同肺癌的病理類型中出現(xiàn)

13、相同的變化。與健康不吸煙組比較，miR-154-5p在鱗癌組和腺癌組中均呈表達下調(diào)，有統(tǒng)計學意義。與健康吸煙組比較， miR-154-5p在鱗癌組和腺癌組中表達差異無統(tǒng)計學意義。與腺癌組相比， miR-154-5p在鱗癌組中表達差異無統(tǒng)計學意義。⑸let-7i-3p和miR-154-5p的相對表達水平與吸煙指數(shù)的相關分析發(fā)現(xiàn)，隨著吸煙指數(shù)增加，let-7i-3p和miR-154-5p的相對表達水平水平逐漸降低。吸煙指數(shù)與let-7i-3

14、p和miR-154-5p的表達水平均呈負相關。⑹與健康不吸煙組相比，肺癌吸煙組和肺癌不吸煙組中的let-7i-3p均呈下調(diào)表達，差異有統(tǒng)計學意義；與健康吸煙組相比，肺癌不吸煙組中的let-7i-3p呈上調(diào)表達，差異有統(tǒng)計學意義，而肺癌吸煙組中的let-7i-3p的表達差異無統(tǒng)計學意義；與肺癌不吸煙組相比，肺癌吸煙組中的let-7i-3p的呈下調(diào)表達，差異有統(tǒng)計學意義。⑺與健康不吸煙組比較，肺癌吸煙組及肺癌不吸煙組中的miR-154-5p

15、的表達均呈下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義；與健康吸煙組相比，肺癌吸煙組和肺癌不吸煙組中的miR-154-5p的表達均無統(tǒng)計學差異；與肺癌不吸煙組相比，肺癌吸煙組中的miR-154-5p的表達差異無統(tǒng)計學意義。⑻通過靶基因預測發(fā)現(xiàn)，let-7i-3p作用的主要靶基因有Adhfe1、ACTB、ATP2A2、BDNF、BTG3、EMP2、DLX5、CXCR6、CXCL12、HES1、RASSF3、Six1等，這些靶基因的信號通路預測結果顯示，其主要參

16、與與肺癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲關系密切的NF-kappa B、MAPK、Notch等信號通路。⑼通過靶基因預測發(fā)現(xiàn)，miR-154-5p作用的主要靶基因有 Abcc9、ROS、ATG7、TNFAIP3、CUL2等。這些靶基因的信號通路預測結果顯示，其主要參與與肺癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲關系密切的NF-kappa B、HIF-1、MAPK、自噬分子調(diào)控等信號通路。
　　結論：①吸煙可誘導人血清miRNA的差異表性表達，表達譜以差異性下調(diào)表達為主

17、，其血清miRNA的表達譜變化與肺癌血清表達譜變化趨向一致，提示吸煙誘發(fā)的血清miRNA表達變化可能與肺癌的形成、發(fā)生、發(fā)展有關。②吸煙可誘導血清let-7i-3p和miR-154-5p持續(xù)性下調(diào)表達，與吸煙指數(shù)呈負相關。血清let-7i-3p和miR-154-5p在肺癌血清中呈下調(diào)表達，let-7i-3p下調(diào)表達水平與非小細胞肺癌病理類型有關，miR-154-5p下調(diào)表達水平與吸煙史相關，結果提示 let-7i-3p和miR-154-