γ-氨基丁酸（GABA）代謝酶抑制劑的研究.pdf

1、γ-氨基丁酸(GABA)是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的主要抑制性遞質(zhì)。GABA的降解主要由GABA轉(zhuǎn)氨酶(GABA-T)催化，脫氨基生成琥珀酸半醛，再經(jīng)琥珀酸半醛脫氫酶(SSADH)催化生成琥珀酸，進(jìn)入三羧酸循環(huán)。增加腦內(nèi)GABA濃度可以提高GABA能系統(tǒng)的神經(jīng)抑制作用，進(jìn)而可用于治療多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病如癲癇/帕金森病/亨廷頓舞蹈癥/Alzheimer病等，最近發(fā)現(xiàn)增加腦內(nèi)GABA濃度還有阻斷藥物依賴的作用。一種增加GABA濃度的方法是設(shè)計(jì)可

2、通過血腦屏障并選擇性抑制GABA-T的化合物。因此GABA-T已經(jīng)被確認(rèn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物的靶點(diǎn)。在本論文中，確定了對(duì)羥基苯甲醛可以作為設(shè)計(jì)GABA-T和SSADH抑制劑的先導(dǎo)化合物，合成并評(píng)價(jià)了兩個(gè)對(duì)羥基苯甲醛類似物對(duì)GABA-T的不可逆抑制作用，研究了黃酮類化合物對(duì)這兩個(gè)酶的抑制作用。另外還研究了豆腐果苷磷脂復(fù)合物的制備/理化性質(zhì)及藥代動(dòng)力學(xué)。主要完成了以下研究工作： (1) 對(duì)羥基苯甲醛表現(xiàn)出對(duì)GABA-T強(qiáng)烈的競(jìng)爭(zhēng)性抑制

3、(IC50=16.5 μmol、L)，這種抑制作用與α-酮戊二酸呈競(jìng)爭(zhēng)性，與GABA呈非競(jìng)爭(zhēng)性。對(duì)羥基苯甲醛也以競(jìng)爭(zhēng)性的方式強(qiáng)烈地抑制SSADH(IC50=24.7 μmol、L)。這種抑制作用是由于對(duì)羥基苯甲醛與α-酮戊二酸及琥珀酸半醛的結(jié)構(gòu)相似性和苯環(huán)的共軛作用導(dǎo)致的。初步的量子化學(xué)計(jì)算表明對(duì)羥基苯甲醛與α-酮戊二酸及琥珀酸半醛的結(jié)構(gòu)相似性本質(zhì)上是它們前線軌道的能量和形狀的相似。這些結(jié)果表明這兩個(gè)酶的活性位點(diǎn)可以接受苯環(huán)的存在，提示

4、對(duì)羥基苯甲醛可以作為先導(dǎo)化合物設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)新穎的GABA-T和SSADH抑制劑。 (2) 考察了6類共17個(gè)對(duì)羥基苯甲醛類似物對(duì)GABA-T和SSADH的抑制作用，其中有8個(gè)對(duì)羥基苯甲醛類似物由本實(shí)驗(yàn)室合成。包括對(duì)羥基苯甲醛總計(jì)18個(gè)化合物對(duì)GABA-T和SSADH的IC50值顯示出明顯的構(gòu)效關(guān)系。對(duì)于GABA-T的抑制，酚羥基及其對(duì)位的羰基或氨甲基是關(guān)鍵的。對(duì)于SSADH的抑制，酚羥基及其對(duì)位的羰基是非常重要的。4-丙烯酰苯酚對(duì)G

5、ABA-T和SSADH的IC50分別為5.48 μmol、L和0.35 μmol、L，4-β-氯丙酰苯酚對(duì)GABA-T和SSADH的IC50分別為3.99 μmol、L和1.09 μmol、L，均表現(xiàn)出極好的抑制活性。對(duì)羥基苯甲胺是一個(gè)強(qiáng)有力的GABA-T抑制劑(IC50= 15.4 μmol、L)，與GABA呈競(jìng)爭(zhēng)性關(guān)系，而與α-酮戊二酸呈非競(jìng)爭(zhēng)性關(guān)系。推測(cè)了一個(gè)統(tǒng)一的機(jī)制解釋對(duì)羥基苯甲醛和對(duì)羥基苯甲胺對(duì)GABA-T的抑制。

6、(3) 4-丙烯酰苯酚以時(shí)間依賴的方式強(qiáng)烈的不可逆抑制GABA-T，其動(dòng)力學(xué)參數(shù)為KI= 470 μmol、L，kinact= 0.061 min-1，kinact、KI= 0.129 (mmol、L)-1min-1。加入α-酮戊二酸可以保護(hù)這種不可逆抑制作用，表明這種抑制作用是發(fā)生在GABA-T的活性部位。巰基乙醇也可以保護(hù)這種抑制作用。提出了一種Michael加成機(jī)制解釋這種不可逆抑制作用。初步的量子化學(xué)計(jì)算結(jié)果也證實(shí)了Michae

7、l加成機(jī)制的合理性。這些結(jié)果為設(shè)計(jì)更有效的GABA-T抑制劑提供了新思路。 (4) 4-β-氯丙酰苯酚以時(shí)間依賴的方式強(qiáng)烈地不可逆抑制GABA-T，其動(dòng)力學(xué)參數(shù)為KI= 24.3 μmol、L，kinact= 0.0467 min-1，kinact、KI= 1.88 (mmol、L)-1min-1。加入α-酮戊二酸可以保護(hù)這種不可逆抑制作用，表明這種抑制作用是發(fā)生在GABA-T的活性部位。巰基乙醇和谷胱甘肽可以保護(hù)這種不可逆抑制

8、作用。公認(rèn)的GABA-T不可逆抑制機(jī)制不能解釋這個(gè)化合物的不可逆抑制作用，因此提出了一種親核取代機(jī)制解釋這種不可逆抑制作用。雖然這個(gè)不可逆抑制機(jī)制需要進(jìn)一步研究確證，但這些結(jié)果表明除了公認(rèn)的兩種機(jī)制還可以通過其他機(jī)制不可逆抑制GABA-T，這為設(shè)計(jì)新穎的GABA-T抑制劑提供了更廣闊的空間。 (5) 黃酮類化合物可以顯著地以劑量依賴的方式抑制GABA-T和SSADH。黃酮類化合物對(duì)GABA-T和SSADH的抑制表現(xiàn)出不同的構(gòu)效關(guān)

9、系。在黃芩素/黃芩苷/野黃芩苷元/野黃芩苷/槲皮素/山奈酚和蘆丁等7個(gè)黃酮類化合物中，黃芩素是GABA-T最有效的抑制劑(IC50=12.8 μmol、L)，野黃芩苷元是SSADH最有效的抑制劑(IC50=7.2 μmol、L)。黃酮類化合物對(duì)GABA-T和SSADH的抑制是非競(jìng)爭(zhēng)性的。這些結(jié)果提示黃酮類化合物對(duì)GABA-T和SSDAH的抑制作用可能是黃酮類化合物神經(jīng)藥理作用的部分原因。 (6) 制備了豆腐果苷磷脂復(fù)合物，并通過

10、正交設(shè)計(jì)考察了反應(yīng)物初始濃度/投料比例和反應(yīng)時(shí)間等因素對(duì)復(fù)合率的影響，表明最佳制備工藝是室溫下以四氫呋喃為反應(yīng)溶劑，豆腐果苷濃度為5 mg、mL，投料質(zhì)量比例為1: 5，反應(yīng)時(shí)間為2 h。X-射線衍射和差熱掃描分析表明復(fù)合物呈現(xiàn)無定型特征，并改變了原藥的相變特征；1H-NMR和IR顯示了豆腐果苷的糖羥基和醛基參與復(fù)合物的結(jié)合。磷脂復(fù)合物可以明顯改善豆腐果苷在水及正辛醇中的溶解性能。磷脂復(fù)合物可以顯著地提高豆腐果苷在大鼠體內(nèi)的生物利用度。