混合物銅(Ⅱ)-2-巰基苯并噻唑的體外抗腫瘤作用及其機制的研究.pdf

1、背景與目的：
　　蛋白質是一切生命的物質基礎，是機體細胞的重要組成部分，而所有的蛋白質幾乎都處于不斷地合成和降解的動態(tài)平衡之中。其中蛋白質的降解主要有2種途徑：第一是溶酶體途徑，它主要負責細胞外的蛋白質和膜蛋白的降解；第二是泛素-蛋白酶體途徑，而它是主要負責真核細胞內絕大多數蛋白質的降解，并且能夠快速、有序、特異、單向參與細胞體內許多重要的生理生化過程(如細胞增殖，分化，凋亡，DNA修復、細胞周期的運轉、蛋白的跨膜定位等)。泛素-

2、蛋白酶體通路的異常和機體的多種疾病相關，其中（如致癌基因蛋白/生長促進因子，CyclinB和HIF等的降解受阻或者抑癌基因蛋白P27和P53的降解加速使細胞生長失控）可以促使腫瘤的發(fā)生。該領域的研究引起了全世界的關注，研發(fā)有效的和特異的調控蛋白酶體的藥物，成為抗腫瘤藥物的新靶點。近年來的研究發(fā)現,某些金屬配合物能夠較強的抑制腫瘤細胞中蛋白酶體活性并能誘導腫瘤細胞凋亡，而且對永生化的正常細胞無毒性作用。這為臨床上研發(fā)新型的蛋白酶體抑制來抗

3、腫瘤開辟了新的道路。本實驗通過研究二巰基苯并噻唑與銅（II）鹽以2:1比例混合在不同腫瘤細胞系上誘導細胞凋亡及影響凋亡的因素來初步探討抗腫瘤作用與蛋白酶體之間的關系，以及篩選出螯合劑二巰基苯并噻唑與金屬離子銅形成配合物的最佳配比。
　　實驗方法：
　　（一）體外抗腫瘤作用及其影響因素
　　1.細胞增殖檢測。MTS法
　　2.細胞死亡檢測
　?。?） Annexin V-FITC-PI流式細胞術
　　（

4、2）熒光顯微鏡活細胞動態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)
　　3.檢測死亡相關蛋白變化情況Western blotting
　　4.蛋白酶體活性檢測細胞內蛋白酶體酶活性的檢測
　　（二）抗腫瘤作用與蛋白酶體功能關系的研究
　　1.蛋白酶體活性檢測細胞內蛋白酶體酶活性的檢測
　　2.檢測相關蛋白變化情況Western blotting
　　實驗結果：
　?。ㄒ唬┭芯裤~（II）-2-巰基苯并噻唑混合物對穩(wěn)定轉染的GFPu-

5、HEK293細胞的蛋白酶體的抑制作用
　　選用穩(wěn)定轉染過GFPu的HEK293細胞為研究對象進行處理，將蛋白酶體抑制劑MG1322.5(μM)作為陽性對照,MT單獨作用于細胞的濃度分別為30、60、90（μM），CuCl2單獨作用于細胞的濃度為15、30、45（μM）以及MT和CuCl2以2:1的比例作用于細胞12小時后：
　?。?）熒光顯微鏡活細胞動態(tài)觀察拍照：結果顯示MG132陽性對照組可看到綠色熒光，MT和CuCl2以

6、2:1比例作用后可看到綠色熒光逐漸增多，呈濃度依賴性；并且形態(tài)學死亡加重呈濃度依賴性。
　　（2）收集細胞，裂解細胞抽提總蛋白進行Western blot蛋白測定。結果顯示：反應UPS系統(tǒng)功能的內源性蛋白Ub,外源性蛋白GFPu在MT和CuCl2以2:1的濃度下開始出現聚集，并且呈現濃度依賴性。
　?。ǘ┭芯克幬镢~-2-巰基苯并噻唑混合物誘導不同種腫瘤細胞死亡，其敏感性不同
　　選用人骨髓瘤細胞NCI-H929和人骨

7、髓瘤細胞U266為研究對象進行處理，MT以不同濃度30、60、90（μM），CuCl2以不同濃度15、30、45（μM）以及MT和CuCl2以2:1比例的混合物分別作用于2種細胞48小時后：采用MTS法檢測到上述混合物作用于細胞后能夠明顯抑制細胞增殖，并且存在濃度依賴關系。同等條件處理這2種細胞36小時后，Annexin V-FITC-PI流式細胞術檢測細胞的死亡情況，發(fā)現上述混合物作用于細胞后能夠明顯誘導細胞死亡，并且存在濃度依賴性。

8、采用熒光顯微鏡活細胞動態(tài)觀察拍照，觀察到上述混合物作用于細胞能夠明顯誘導細胞死亡，并且存在濃度和時間依賴性。采用Western blotting檢測到細胞死亡的相關蛋白 PARP,發(fā)現上述混合物作用于細胞后能夠引起明顯的PARP的切割，并且存在濃度和時間依賴性。
　　選用人肝癌細胞SMMC7721為研究對象進行處理，MT以不同濃度30、40、50、60（μM）,CuCl2以不同濃度15、20、25、30（μM）以及 MT和CuCl

9、2以2:1比例的混合物分別作用于細胞24小時后：采用MTS法檢測到上述混合物作用于細胞后能夠明顯抑制細胞增殖，抑制程度差不多相同。同等條件處理細胞24小時，Annexin V-FITC-PI雙染后，采用熒光顯微鏡觀察拍照，觀察到上述混合物作用于細胞能夠明顯誘導細胞死亡，細胞死亡程度差不多相同。MT以不同濃度30、40、50、60（μM）,CuCl2以30（μM）以及MT和CuCl2混合后分別作用于細胞6小時后，檢測細胞內酶活性，發(fā)現混合

10、物抑制細胞內酶活性幾乎一致均在60％左右。為了和人骨髓瘤細胞做出比較，調整藥物濃度 MT以不同濃度30、60、90（μM），CuCl2以不同濃度15、30、45（μM）以及MT和CuCl2以2:1比例的混合物分別作用于細胞，采用Western blotting檢測到細胞死亡的相關蛋白 PARP,發(fā)現上述混合物作用于細胞后能夠引起明顯的PARP的切割，并且存在濃度和時間依賴性。
　　以上結果得出藥物銅-2-巰基苯并噻唑混合物可以誘導

11、不同種腫瘤細胞死亡，但是對人肝癌細胞SMMC7721更為敏感一些。
　　(三)研究人骨髓瘤細胞NCI-H929和人肝癌細胞SMMC7721的死亡途徑與其抑制細胞內蛋白酶體活性的關系
　　選用人骨髓瘤細胞NCI-H929和人肝癌細胞SMMC7721為研究對象進行處理，MT以不同濃度30、60、90（μM），CuCl2以不同濃度15、30、45（μM）以及MT和CuCl2以2:1比例的混合物分別作用于2種細胞6小時后，檢測細胞內

12、酶活性，發(fā)現混合物能夠明顯抑制細胞內酶活性，并且呈濃度依賴性。以相同的處理方法作用于NCI-H929細胞，采用Western blotting檢測到反應UPS系統(tǒng)的內源性蛋白Ub,細胞死亡的相關蛋白PARP,以及Caspase家族相關蛋白，發(fā)現上述混合物作用于細胞NCI-H929后12小時能夠引起明顯的Ub聚集，并且成濃度依賴性，隨著時間的增加，Ub逐漸降解。同時引起PARP的切割，并且存在濃度和時間依賴性。Caspase家族相關蛋白C

13、aspase-3，Caspase-8，Caspase-9前體減少，呈濃度依賴性。作用于細胞SMMC7721后12小時能夠引起明顯的Ub聚集，并且成濃度依賴性，隨著時間的增加，Ub呈現穩(wěn)定狀態(tài)。同時引起PARP的切割，并且存在濃度和時間依賴性。Caspase家族相關蛋白Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9前體減少，Caspase-3，Caspase-9出現切割帶，并且呈濃度-時間依賴性。
　　上述2種細胞蛋白酶

14、體活性的抑制都出現在細胞死亡之前，因此得出銅-2-巰基苯并噻唑混合物通過抑制細胞內酶活性從而誘導細胞死亡，并且可能是和Caspase系統(tǒng)的活化有關。
　　（四）研究不同血清濃度影響藥物對細胞的死亡誘導與其細胞內蛋白酶體活性的關系。
　　選用人肝癌細胞 SMMC-7721為研究對象進行處理，給予0%，1%，10%的不同血清濃度，MT以不同濃度30、60、90（μM），CuCl2以不同濃度15、30、45（μM）以及MT和CuC

15、l2以2:1的比例作用于細胞，在不同時間點觀察細胞，結果顯示：隨著血清濃度的降低，藥物誘導細胞死亡存在時間和濃度依賴性。以相同的方法處理細胞6小時后，檢測細胞內酶活性，發(fā)現藥物抑制細胞內蛋白酶體活性并不明顯。
　　結論：
　　1.銅-2-巰基苯并噻唑混合物引起內源性和外源性蛋白酶體底物蛋白的聚集。
　　2.銅-2-巰基苯并噻唑混合物能夠誘導不同種腫瘤細胞死亡，但其敏感性不同。
　　3.銅-2-巰基苯并噻唑混合物通