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文檔簡(jiǎn)介
1、背景與目的:
蛋白質(zhì)是一切生命的物質(zhì)基礎(chǔ),是機(jī)體細(xì)胞的重要組成部分,而所有的蛋白質(zhì)幾乎都處于不斷地合成和降解的動(dòng)態(tài)平衡之中。其中蛋白質(zhì)的降解主要有2種途徑:第一是溶酶體途徑,它主要負(fù)責(zé)細(xì)胞外的蛋白質(zhì)和膜蛋白的降解;第二是泛素-蛋白酶體途徑,而它是主要負(fù)責(zé)真核細(xì)胞內(nèi)絕大多數(shù)蛋白質(zhì)的降解,并且能夠快速、有序、特異、單向參與細(xì)胞體內(nèi)許多重要的生理生化過程(如細(xì)胞增殖,分化,凋亡,DNA修復(fù)、細(xì)胞周期的運(yùn)轉(zhuǎn)、蛋白的跨膜定位等)。泛素-
2、蛋白酶體通路的異常和機(jī)體的多種疾病相關(guān),其中(如致癌基因蛋白/生長(zhǎng)促進(jìn)因子,CyclinB和HIF等的降解受阻或者抑癌基因蛋白P27和P53的降解加速使細(xì)胞生長(zhǎng)失控)可以促使腫瘤的發(fā)生。該領(lǐng)域的研究引起了全世界的關(guān)注,研發(fā)有效的和特異的調(diào)控蛋白酶體的藥物,成為抗腫瘤藥物的新靶點(diǎn)。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),某些金屬配合物能夠較強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞中蛋白酶體活性并能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,而且對(duì)永生化的正常細(xì)胞無(wú)毒性作用。這為臨床上研發(fā)新型的蛋白酶體抑制來(lái)抗
3、腫瘤開辟了新的道路。本實(shí)驗(yàn)通過研究二巰基苯并噻唑與銅(II)鹽以2:1比例混合在不同腫瘤細(xì)胞系上誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及影響凋亡的因素來(lái)初步探討抗腫瘤作用與蛋白酶體之間的關(guān)系,以及篩選出螯合劑二巰基苯并噻唑與金屬離子銅形成配合物的最佳配比。
實(shí)驗(yàn)方法:
?。ㄒ唬w外抗腫瘤作用及其影響因素
1.細(xì)胞增殖檢測(cè)。MTS法
2.細(xì)胞死亡檢測(cè)
?。?) Annexin V-FITC-PI流式細(xì)胞術(shù)
?。?/p>
4、2)熒光顯微鏡活細(xì)胞動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)
3.檢測(cè)死亡相關(guān)蛋白變化情況Western blotting
4.蛋白酶體活性檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白酶體酶活性的檢測(cè)
?。ǘ┛鼓[瘤作用與蛋白酶體功能關(guān)系的研究
1.蛋白酶體活性檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白酶體酶活性的檢測(cè)
2.檢測(cè)相關(guān)蛋白變化情況Western blotting
實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
?。ㄒ唬┭芯裤~(II)-2-巰基苯并噻唑混合物對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的GFPu-
5、HEK293細(xì)胞的蛋白酶體的抑制作用
選用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過GFPu的HEK293細(xì)胞為研究對(duì)象進(jìn)行處理,將蛋白酶體抑制劑MG1322.5(μM)作為陽(yáng)性對(duì)照,MT單獨(dú)作用于細(xì)胞的濃度分別為30、60、90(μM),CuCl2單獨(dú)作用于細(xì)胞的濃度為15、30、45(μM)以及MT和CuCl2以2:1的比例作用于細(xì)胞12小時(shí)后:
?。?)熒光顯微鏡活細(xì)胞動(dòng)態(tài)觀察拍照:結(jié)果顯示MG132陽(yáng)性對(duì)照組可看到綠色熒光,MT和CuCl2以
6、2:1比例作用后可看到綠色熒光逐漸增多,呈濃度依賴性;并且形態(tài)學(xué)死亡加重呈濃度依賴性。
?。?)收集細(xì)胞,裂解細(xì)胞抽提總蛋白進(jìn)行Western blot蛋白測(cè)定。結(jié)果顯示:反應(yīng)UPS系統(tǒng)功能的內(nèi)源性蛋白Ub,外源性蛋白GFPu在MT和CuCl2以2:1的濃度下開始出現(xiàn)聚集,并且呈現(xiàn)濃度依賴性。
(二)研究藥物銅-2-巰基苯并噻唑混合物誘導(dǎo)不同種腫瘤細(xì)胞死亡,其敏感性不同
選用人骨髓瘤細(xì)胞NCI-H929和人骨
7、髓瘤細(xì)胞U266為研究對(duì)象進(jìn)行處理,MT以不同濃度30、60、90(μM),CuCl2以不同濃度15、30、45(μM)以及MT和CuCl2以2:1比例的混合物分別作用于2種細(xì)胞48小時(shí)后:采用MTS法檢測(cè)到上述混合物作用于細(xì)胞后能夠明顯抑制細(xì)胞增殖,并且存在濃度依賴關(guān)系。同等條件處理這2種細(xì)胞36小時(shí)后,Annexin V-FITC-PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的死亡情況,發(fā)現(xiàn)上述混合物作用于細(xì)胞后能夠明顯誘導(dǎo)細(xì)胞死亡,并且存在濃度依賴性。
8、采用熒光顯微鏡活細(xì)胞動(dòng)態(tài)觀察拍照,觀察到上述混合物作用于細(xì)胞能夠明顯誘導(dǎo)細(xì)胞死亡,并且存在濃度和時(shí)間依賴性。采用Western blotting檢測(cè)到細(xì)胞死亡的相關(guān)蛋白 PARP,發(fā)現(xiàn)上述混合物作用于細(xì)胞后能夠引起明顯的PARP的切割,并且存在濃度和時(shí)間依賴性。
選用人肝癌細(xì)胞SMMC7721為研究對(duì)象進(jìn)行處理,MT以不同濃度30、40、50、60(μM),CuCl2以不同濃度15、20、25、30(μM)以及 MT和CuCl
9、2以2:1比例的混合物分別作用于細(xì)胞24小時(shí)后:采用MTS法檢測(cè)到上述混合物作用于細(xì)胞后能夠明顯抑制細(xì)胞增殖,抑制程度差不多相同。同等條件處理細(xì)胞24小時(shí),Annexin V-FITC-PI雙染后,采用熒光顯微鏡觀察拍照,觀察到上述混合物作用于細(xì)胞能夠明顯誘導(dǎo)細(xì)胞死亡,細(xì)胞死亡程度差不多相同。MT以不同濃度30、40、50、60(μM),CuCl2以30(μM)以及MT和CuCl2混合后分別作用于細(xì)胞6小時(shí)后,檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)酶活性,發(fā)現(xiàn)混合
10、物抑制細(xì)胞內(nèi)酶活性幾乎一致均在60%左右。為了和人骨髓瘤細(xì)胞做出比較,調(diào)整藥物濃度 MT以不同濃度30、60、90(μM),CuCl2以不同濃度15、30、45(μM)以及MT和CuCl2以2:1比例的混合物分別作用于細(xì)胞,采用Western blotting檢測(cè)到細(xì)胞死亡的相關(guān)蛋白 PARP,發(fā)現(xiàn)上述混合物作用于細(xì)胞后能夠引起明顯的PARP的切割,并且存在濃度和時(shí)間依賴性。
以上結(jié)果得出藥物銅-2-巰基苯并噻唑混合物可以誘導(dǎo)
11、不同種腫瘤細(xì)胞死亡,但是對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC7721更為敏感一些。
(三)研究人骨髓瘤細(xì)胞NCI-H929和人肝癌細(xì)胞SMMC7721的死亡途徑與其抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白酶體活性的關(guān)系
選用人骨髓瘤細(xì)胞NCI-H929和人肝癌細(xì)胞SMMC7721為研究對(duì)象進(jìn)行處理,MT以不同濃度30、60、90(μM),CuCl2以不同濃度15、30、45(μM)以及MT和CuCl2以2:1比例的混合物分別作用于2種細(xì)胞6小時(shí)后,檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)
12、酶活性,發(fā)現(xiàn)混合物能夠明顯抑制細(xì)胞內(nèi)酶活性,并且呈濃度依賴性。以相同的處理方法作用于NCI-H929細(xì)胞,采用Western blotting檢測(cè)到反應(yīng)UPS系統(tǒng)的內(nèi)源性蛋白Ub,細(xì)胞死亡的相關(guān)蛋白PARP,以及Caspase家族相關(guān)蛋白,發(fā)現(xiàn)上述混合物作用于細(xì)胞NCI-H929后12小時(shí)能夠引起明顯的Ub聚集,并且成濃度依賴性,隨著時(shí)間的增加,Ub逐漸降解。同時(shí)引起PARP的切割,并且存在濃度和時(shí)間依賴性。Caspase家族相關(guān)蛋白C
13、aspase-3,Caspase-8,Caspase-9前體減少,呈濃度依賴性。作用于細(xì)胞SMMC7721后12小時(shí)能夠引起明顯的Ub聚集,并且成濃度依賴性,隨著時(shí)間的增加,Ub呈現(xiàn)穩(wěn)定狀態(tài)。同時(shí)引起PARP的切割,并且存在濃度和時(shí)間依賴性。Caspase家族相關(guān)蛋白Caspase-3,Caspase-8,Caspase-9前體減少,Caspase-3,Caspase-9出現(xiàn)切割帶,并且呈濃度-時(shí)間依賴性。
上述2種細(xì)胞蛋白酶
14、體活性的抑制都出現(xiàn)在細(xì)胞死亡之前,因此得出銅-2-巰基苯并噻唑混合物通過抑制細(xì)胞內(nèi)酶活性從而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡,并且可能是和Caspase系統(tǒng)的活化有關(guān)。
?。ㄋ模┭芯坎煌鍧舛扔绊懰幬飳?duì)細(xì)胞的死亡誘導(dǎo)與其細(xì)胞內(nèi)蛋白酶體活性的關(guān)系。
選用人肝癌細(xì)胞 SMMC-7721為研究對(duì)象進(jìn)行處理,給予0%,1%,10%的不同血清濃度,MT以不同濃度30、60、90(μM),CuCl2以不同濃度15、30、45(μM)以及MT和CuC
15、l2以2:1的比例作用于細(xì)胞,在不同時(shí)間點(diǎn)觀察細(xì)胞,結(jié)果顯示:隨著血清濃度的降低,藥物誘導(dǎo)細(xì)胞死亡存在時(shí)間和濃度依賴性。以相同的方法處理細(xì)胞6小時(shí)后,檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)酶活性,發(fā)現(xiàn)藥物抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白酶體活性并不明顯。
結(jié)論:
1.銅-2-巰基苯并噻唑混合物引起內(nèi)源性和外源性蛋白酶體底物蛋白的聚集。
2.銅-2-巰基苯并噻唑混合物能夠誘導(dǎo)不同種腫瘤細(xì)胞死亡,但其敏感性不同。
3.銅-2-巰基苯并噻唑混合物通
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