鋅指蛋白Apak的表達與腫瘤相關(guān)性的研究.pdf

1、背景：
　　KZNF蛋白是哺乳動物體內(nèi)最大的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族,它的蛋白結(jié)構(gòu)中包括KRAB結(jié)構(gòu)域和多個鋅指結(jié)構(gòu)。鋅指結(jié)構(gòu)近似一個手型,可以與目的基因特異結(jié)合,一個鋅指結(jié)構(gòu)可以與3~4核苷酸相互作用,不同鋅指結(jié)構(gòu)結(jié)合的 DNA序列不同。KRAB結(jié)構(gòu)域能夠募集組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶、組蛋白去乙?；?、異染色質(zhì)蛋白等抑制細胞轉(zhuǎn)錄。KZNF蛋白通過鋅指結(jié)構(gòu)與靶基因結(jié)合,再通過KRAB結(jié)構(gòu)域抑制靶基因轉(zhuǎn)錄,參與細胞生命活動的調(diào)控。KZNF蛋白具有

2、抑制RNA聚合酶I、II和III引物的轉(zhuǎn)錄,調(diào)控核仁功能,結(jié)合與剪接RNA的功能。
　　Apak蛋白是本實驗室發(fā)現(xiàn)與研究的一種KZNF蛋白,由ZNF420基因編碼,是抑癌蛋白p53的負調(diào)控分子。在正常細胞中,Apak通過輔抑制蛋白KAP1聚集組蛋白去乙?；窰DAC1和ATM激酶與p53結(jié)合形成復(fù)合體,使p53的乙?；较抡{(diào),抑制 p53相關(guān)的凋亡靶基因表達,抑制細胞凋亡,而對 p53參與的其它生理功能沒有明顯的調(diào)控作用。在烷化

3、劑MMS誘導(dǎo)的DNA損傷情況下,ATM被激活,Apak的Ser68位點發(fā)生磷酸化,磷酸化狀態(tài)的Apak與p53解離,解除了對p53的抑制作用,p53激活,細胞凋亡。
　　目的：
　　探討作為KZNF家族的Apak蛋白是否有不依賴于p53的其它作用機制,Apak蛋白對細胞生長增殖有什么作用,Apak蛋白的表達與腫瘤有怎樣的相關(guān)性,希望為腫瘤的早期診斷和防治提供新的預(yù)警分子。
　　方法：
　　本實驗采取病例對照研究設(shè)

4、計,選取15例胃癌患者和20例結(jié)直腸癌患者腫瘤樣本作為病例組,同一患者的腫瘤旁正常組織作為對照組,采用 Western blotting方法檢測腫瘤組織中Apak蛋白的表達水平。培養(yǎng) H1299細胞,轉(zhuǎn)染GFP-C3,GFP-Apak,shRNA-con,shRNA-Apak四種質(zhì)粒,采用實時熒光定量PCR的方法檢測rRNA的水平,采用流式細胞檢測細胞周期,采用MTT方法檢測細胞增殖,采用ChIP方法檢測與Apak蛋白結(jié)合的DNA序列,

5、并對結(jié)果進行分析。
　　結(jié)果：
　　1、對本實驗人群中的15例胃癌患者及20例結(jié)直腸癌患者的組織標本,采用Western blotting方法檢測Apak蛋白表達水平,發(fā)現(xiàn)對于同一患者,與腫瘤旁正常組織相比,腫瘤組織中Apak蛋白水平下調(diào),并且,p53突變的細胞中,Apak蛋白下調(diào)水平更顯著,說明Apak蛋白在腫瘤組織中有不依賴于p53的其它作用機制。
　　2、分四個培養(yǎng)瓶培養(yǎng)H1299細胞,分別轉(zhuǎn)染GFP-C3,GF

6、P-Apak,shRNA-con, shRNA-Apak四種質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染48小時后,收細胞,提取細胞RNA,利用實時熒光定量PCR檢測rRNA的表達水平,利用Western blotting方法檢測Apak蛋白的表達水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Apak蛋白能夠抑制rRNA的合成。
　　3、分兩個培養(yǎng)瓶培養(yǎng) H1299細胞,分別轉(zhuǎn)染 GFP-C3,GFP-Apak兩種質(zhì)粒,48小時候后收細胞,使用流式細胞儀檢測細胞周期,結(jié)果發(fā)現(xiàn),Apak蛋白使大部

7、分H1299細胞在G1期阻滯。
　　4、在H1299細胞中,分別轉(zhuǎn)染GFP-C3,GFP-Apak,shRNA-con,shRNA-Apak四種質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染48 h后,G418處理,2~3周后獲得穩(wěn)定表達Apak和穩(wěn)定敲低Apak的細胞系,利用MTT方法檢測細胞的增殖,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Apak蛋白抑制細胞生長。
　　5、利用染色質(zhì)免疫沉淀方法(ChIP)發(fā)現(xiàn) Apak能夠與45SpreRNA的調(diào)控區(qū)結(jié)合,其結(jié)合的DNA序列是TCTTN

8、2-30TTGT。
　　6、設(shè)置三個實驗組,每組含有兩瓶分別轉(zhuǎn)染了 shRNA-con和 shRNA-Apak質(zhì)粒的H1299細胞,第一組作為對照組,不加任何藥劑;第二組加入TSA;第三組加入5’-Aza,一段時間后收細胞,提取細胞RNA,利用實時熒光定量PCR檢測preRNA的水平。結(jié)果表明Apak能夠使rRNA調(diào)控區(qū)發(fā)生甲基化,即Apak對rRNA調(diào)控區(qū)存在表觀遺傳學(xué)修飾。
　　結(jié)論：
　　1、在腫瘤組織中 Apa