中風(fēng)后遺癥“氣虛血瘀”模型大鼠運(yùn)動(dòng)功能及神經(jīng)元突觸變化及補(bǔ)陽(yáng)還五湯的作用.pdf

1、目的：根據(jù)中醫(yī)對(duì)中風(fēng)后遺癥病因病機(jī)的認(rèn)識(shí)，采用多因素復(fù)合方法制作中風(fēng)后遺“氣虛血瘀”大鼠病證模型。在以前工作的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀察該模型大鼠運(yùn)動(dòng)功能和神經(jīng)元突觸變化以及補(bǔ)陽(yáng)還五湯拆方各組的影響作用，從而為該模型的建立以及補(bǔ)陽(yáng)還五湯藥理作用提供依據(jù)。 方法：采用先開(kāi)顱結(jié)扎大腦中動(dòng)脈，再用“大鼠電脈沖隨機(jī)刺激儀”多因素復(fù)合方法制作大鼠中風(fēng)后遺癥“氣虛血瘀”病證模型；實(shí)驗(yàn)分對(duì)照(NG)、急性期(APG)、模型(SG)和給藥(總方、去地龍

2、、當(dāng)歸補(bǔ)血)等6組。以模型大鼠的“偏癱”癥狀和“氣虛血瘀”外在表現(xiàn)、行為評(píng)分、腦組織梗死體積、病理變化作為模型成立的基本標(biāo)準(zhǔn)。 補(bǔ)陽(yáng)還五湯拆分為總方、去地龍、當(dāng)歸補(bǔ)血三部分，水煮提取制備，以黃芪甲苷(AstragalosideⅣ)、阿魏酸(Ferulicacid)、多糖作為質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。黃芪甲苷的含量采用高效液相色譜—蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(HPLC-ELSD)測(cè)定；阿魏酸的含量采用高效液相色譜(ELSD)測(cè)定；多糖的含量采用苯酚—硫

3、酸法測(cè)定。 走橫木試驗(yàn)根據(jù)Kawamatat等采用的動(dòng)物行為測(cè)度評(píng)分，并在走橫木實(shí)驗(yàn)(beamwalkingtest)的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，來(lái)判斷大鼠的精細(xì)運(yùn)動(dòng)功能。 在光鏡、電鏡下觀察腦組織病理變化。 用電鏡配合圖像分析儀測(cè)量大鼠腦組織神經(jīng)元突觸數(shù)目、突觸活性區(qū)長(zhǎng)度、突觸間隙寬度及突觸后膜致密物質(zhì)厚度等結(jié)構(gòu)參數(shù)的變化。 結(jié)果：(1)模型基本指標(biāo)①癥狀和體征：與NG組比較，APG、SG組均有明顯的中風(fēng)后偏癱癥

4、狀，表現(xiàn)為左上肢內(nèi)收，無(wú)力，攀爬鼠籠時(shí)向一側(cè)傾倒，下肢外展，內(nèi)收困難，走路跳躍時(shí)均呈跛行狀態(tài)；有面癱癥狀，左眼大，右眼?。惶崞鹗笪矔r(shí)大鼠不能正常卷起身體，只能不停抖動(dòng)身體；左側(cè)睪丸萎縮。與APG組比較，SG組除有以上中風(fēng)偏癱癥狀外，還有毛發(fā)暗淡無(wú)光澤、卷曲，精神萎靡，表情驚恐，消瘦，肢體無(wú)力，大便稀溏，攝食，飲水減少，手術(shù)傷口愈合遲緩等“氣虛血瘀”外在表現(xiàn)。 ②梗死體積計(jì)算：梗死率判斷大鼠平均梗死體積計(jì)算為107.44±11.0

5、4mm3，約占大鼠腦組織體積的10％左右，梗死灶相對(duì)較小，這與我們電凝的大腦中動(dòng)脈分支支配的范圍較小相吻合，也是接近于臨床病人腦梗塞比例。 (2)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分APG組運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分(4.33±1.67)顯著低于NG組[(7±0)，P＜0.01]，SG組運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分(6±0.18)也顯著低于NG組[(7±0)，P＜0.01]。SG組運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分(6±0.18)顯著高于APG組[(4.33±1.67)，P＜0.01]。 (3)

6、腦組織病理：光鏡下NG組神經(jīng)細(xì)胞分布均勻，胞體形態(tài)正常，胞核部分形態(tài)均勻；SG組神經(jīng)細(xì)胞大都變性壞死，胞核大部分呈固縮狀態(tài)，視野中細(xì)胞少見(jiàn)。電鏡下，NG組大鼠腦組織布滿(mǎn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，胞質(zhì)中未見(jiàn)空泡，組織分布均勻；SG組組織分布疏松，見(jiàn)大量胞漿空泡，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)部分?jǐn)嚅_(kāi)，線(xiàn)料體多見(jiàn)，大部分線(xiàn)粒體腫脹，邊緣破裂模糊，髓鞘可見(jiàn)分離破裂。 (4)神經(jīng)元突觸變化：NG組與APG期、SG組的突觸在缺血區(qū)、海馬區(qū)都具有符合興奮性突觸的形態(tài)特點(diǎn)，突觸

7、后膜有密而厚的電子致密物質(zhì)，突觸囊泡呈圓形。突觸前膜與后膜界限清晰。缺血區(qū)SG組同NG組與APG組相比，突觸數(shù)目明顯增多[(8.33±0.91)，P＜0.05]。突觸間隙明顯變窄[(10.13±0.56)，P＜0.05]，突觸活性區(qū)長(zhǎng)度明顯變長(zhǎng)[(127.12±10.38)，P＜0.05]，突觸后膜致密物質(zhì)厚度增厚[(76.78±3.45)，P＜0.05]。海馬區(qū)的各參數(shù)無(wú)差異(P＞0.05)。 (5)補(bǔ)陽(yáng)還五湯拆方各組作用：①

8、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)：黃芪甲苷在0.24-6.00ug范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，阿魏酸在0.08～0.24ug范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，多糖在0.102-0.610ug范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。 ②各給藥組癥狀體征的變化：術(shù)后35天后，模型組，各給藥組大鼠肢體偏癱癥狀都有一定改善，但總方組改善較為明顯，除偏癱癥狀改善外，飲食和飲水增加，體質(zhì)量增加，行動(dòng)相對(duì)敏捷，毛發(fā)較以前有光澤；其余兩給藥組偏癱亦有好轉(zhuǎn)，但精神略顯不振且大便溏，傷口愈合較緩慢 ③

9、術(shù)后35天后，模型組及各給藥組運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分均高于20天評(píng)分(P＜0.05)，表明模型組隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠的運(yùn)動(dòng)功能有一定的恢復(fù)；術(shù)后35天后各給藥組與模型組相比，總方組評(píng)分有明顯改變，表明補(bǔ)陽(yáng)還五湯更有利于促進(jìn)大鼠運(yùn)動(dòng)功能的加速恢復(fù)。 ④光鏡下總方組神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)基本正常，僅見(jiàn)少量細(xì)胞核固縮，組織分布均勻。去地龍組大鼠腦組織神經(jīng)元細(xì)胞核固縮，僅見(jiàn)少量細(xì)胞形態(tài)正常。當(dāng)歸補(bǔ)血組大部分神經(jīng)元細(xì)胞核固縮，組織分布網(wǎng)狀。 ⑤電鏡

10、下，總方組神經(jīng)元細(xì)胞核膜基本完整，核仁尚在，胞質(zhì)可見(jiàn)，線(xiàn)粒體及核糖體結(jié)構(gòu)較為完整，大量星形膠質(zhì)細(xì)胞。去地龍組大鼠腦組織神經(jīng)元細(xì)胞腫脹破裂，核膜較完整，核仁消失，可見(jiàn)部分核糖體，少量星形膠質(zhì)細(xì)胞；當(dāng)歸補(bǔ)血組神經(jīng)元細(xì)胞核膜不完整，核仁形態(tài)不規(guī)則，部分溶解，線(xiàn)粒體等細(xì)胞器減少。 ⑥模型組、總方組、去地龍組、當(dāng)歸補(bǔ)血組突觸數(shù)目較正常組比較有所增多，但總方組突觸數(shù)目增多較其它各組更為明顯[(21.125±1.125)，P＜0.05]。突觸

11、間隙明顯變窄[(14.683±0.115)，P＜0.05]，突觸活性區(qū)長(zhǎng)度明顯變長(zhǎng)[(118.616±2.316)，P＜0.05]，突觸后膜致密物質(zhì)厚度增厚[(96.546±4.247)，P＜0.05}。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)是在對(duì)中風(fēng)后遺癥及主治方補(bǔ)陽(yáng)還五湯文獻(xiàn)研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合以前研究工作成果，采用多因素復(fù)合方法制作中風(fēng)后遺癥“氣虛血瘀”大鼠病證模型，進(jìn)一步觀察該模型大鼠運(yùn)動(dòng)功能和神經(jīng)元突觸變化以及補(bǔ)陽(yáng)還五湯拆方各組的影響作用，從而

12、為該模型的建立以及補(bǔ)陽(yáng)還五湯藥理作用提供依據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用多因素復(fù)合方法制作的大鼠中風(fēng)后遺癥“氣虛血瘀”動(dòng)物病證模型符合中醫(yī)“證”基本要求，貼近臨床。以黃芪甲苷、阿魏酸、多糖作為補(bǔ)陽(yáng)還五湯及其拆方的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)可以保證實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性；中風(fēng)后的運(yùn)動(dòng)功能障礙以四肢遠(yuǎn)端精細(xì)運(yùn)動(dòng)損害為主，因此，肢體的運(yùn)動(dòng)功能是反應(yīng)中風(fēng)病的一個(gè)外在的體征表現(xiàn)，模型大鼠的運(yùn)動(dòng)功能明顯降低。根據(jù)一般體征、走橫木試驗(yàn)，腦組織病理變化等結(jié)果中，表明中風(fēng)后遺癥期神經(jīng)元

13、突觸的變化與神經(jīng)功能康復(fù)密切相關(guān)，并在一定程度上反映了與中風(fēng)急性期的差異，有助于中風(fēng)后遺癥“氣虛血瘀”動(dòng)物模型的判定。本實(shí)驗(yàn)主要是觀察中風(fēng)后遺癥期“氣虛血瘀”大鼠病證模型運(yùn)動(dòng)功能及神經(jīng)元突觸的變化及補(bǔ)陽(yáng)還五湯的影響。在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽(yáng)還五湯可明顯改善模型大鼠的運(yùn)動(dòng)功能，促進(jìn)偏癱肢體的恢復(fù)，改善模型大鼠受損的神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)。表明該方可改善氣血灌注，協(xié)調(diào)陰陽(yáng)平衡，增加組織和器官的血液供應(yīng)，疏通腦絡(luò)，引起神經(jīng)沖動(dòng)，經(jīng)平時(shí)少起作用的旁路刺激

14、大腦皮層，引起壞死邊緣區(qū)的突觸數(shù)目及結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而影響了偏癱肢體的運(yùn)動(dòng)功能。糾正腦缺血缺氧所致的神經(jīng)元代謝紊亂，從而減輕腦水腫和繼發(fā)性腦損害，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)，具有明顯的活血化瘀，疏通經(jīng)絡(luò)作用，且在總方組作用顯著。其機(jī)理與該方能促進(jìn)腦缺血損傷時(shí)腦組織神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)因子上調(diào)，可促進(jìn)神經(jīng)元的存活、保持突觸功能和修復(fù)。可在多靶點(diǎn)上對(duì)腦神經(jīng)元可塑性發(fā)揮整合調(diào)節(jié)作用。表現(xiàn)為有效地阻抑腦缺血導(dǎo)致的神經(jīng)元潰變、死亡，促進(jìn)突觸結(jié)構(gòu)再建，也反映了該方