EMT核轉(zhuǎn)錄因子zeb1-zeb2及其調(diào)節(jié)因子miR-200s在大鼠肝纖維化及中藥干預(yù)過程中動態(tài)表達(dá)變化研究.pdf

1、慢性肝病是一組嚴(yán)重危害人類健康的疾病,基本上所有慢性肝病均有肝纖維化的病理改變,若不能加以控制或阻斷進(jìn)而可發(fā)展為肝硬化、或原發(fā)性肝癌。肝纖維化(Hepaticfibrosis)的病理特征是以細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)在肝臟內(nèi)大量異常沉積為主。國際著名肝臟病學(xué)家Rogking明確提出人典型發(fā)展的肝纖維化是完全可以逆轉(zhuǎn),因此,盡快闡明肝纖維化的發(fā)生機(jī)制,尋找到有效逆轉(zhuǎn)肝纖維化的方法或藥物,成為近十年來世界肝

2、病醫(yī)學(xué)領(lǐng)域攻關(guān)中的熱點(diǎn)課題。近年來,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,后基因組時代的到來及微小RNA的發(fā)現(xiàn),關(guān)于肝纖維化和微小RNA(miRNA)作用關(guān)系的研究報道日漸增多。miRNA是一類具有18-24個核苷酸的單鏈小RNA,它廣泛存在于真核生物中,具有高度保守性、時序性和組織特異性,對生命過程中的一系列重要進(jìn)程有決定性調(diào)節(jié)意義。miR-200家族(miRNA200s)由miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141、m

3、iR-429共5個成員組成,大量研究證實miRNA200s可通過調(diào)節(jié)如鋅指E盒結(jié)合蛋白(zinc-fingerE-box-bindinghomeobox,ZEB)等核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子參與多種細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)的過程從而達(dá)到調(diào)節(jié)臟器纖維化發(fā)生發(fā)展的作用。但肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中EMT的發(fā)生和EMT核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子ZEB家族表達(dá)變化,以及與miRNA200s可能的的調(diào)節(jié)

4、關(guān)系尚未見系統(tǒng)報道,本課題正是在此研究背景的基礎(chǔ)上以闡明肝纖維化過程中ZEB1/ZEB2及其調(diào)節(jié)因子miR-200s表達(dá)變化及其參與調(diào)節(jié)EMT的機(jī)制為目的,同時引入對肝纖維化有明顯防治作用的中藥丹芍化纖膠囊作為干預(yù),并在體外細(xì)胞水平進(jìn)行了相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制的研究。
　　第一部分:大鼠肝纖維化形成及中藥丹芍化纖膠囊干預(yù)過程中EMT發(fā)生及ZEB1/ZEB2、miR-200s動態(tài)表達(dá)變化研究
　　目的:研究大鼠慢性肝損傷致肝纖維化及中藥

5、丹芍化纖膠囊干預(yù)過程中與上皮-間葉轉(zhuǎn)化(EMT)調(diào)控相關(guān)因子微小RNA200家族成員及E盒結(jié)合鋅指蛋白1,2(zinc-fingerE-box-bindinghomeobox1/2,ZEB1/ZEB2)動態(tài)表達(dá)變化。
　　方法:皮下注射四氯化碳(CCL4)復(fù)制大鼠慢性肝損傷致肝纖維化模型,分別在2周、4周、6周和8周處死動物,干預(yù)組在皮下注射CCL4同時給予丹芍化纖膠囊(0.5g/kg)灌胃,分別在4周、8周處死大鼠;計算肝臟指數(shù)

6、、檢測大鼠血清ALT/AST含量;光鏡下觀察肝臟病理結(jié)構(gòu)變化;采用實時熒光定量PCR方法檢測大鼠肝組織miRNA200s的表達(dá)變化;采用實時熒光定量PCR、免疫組織化學(xué)方法、免疫印跡法(westernblotting)從基因及蛋白水平檢測E鈣粘結(jié)蛋白(E-cadherin)、平滑肌α肌動蛋白(α-smoothmuscleactin,α-SMA)、ZEB1與ZEB2的動態(tài)表達(dá)變化。
　　結(jié)果:模型各組及干預(yù)4周組大鼠肝臟指數(shù)、ALT

7、及AST含量皆明顯高于正常對照組(P<0.01);8周模型組大鼠肝臟光鏡下可見明顯肝纖維化病理改變;模型各組大鼠肝組織中α-SMA蛋白及mRNA表達(dá)量隨著肝損傷及纖維化程度加重逐漸增加,而E-cadherin蛋白及mRNA表達(dá)量則逐漸降低;模型2周組中miRNA-200a、miRNA-200c、miRNA-141表達(dá)量皆明顯高于正常對照組(P<0.01);模型4周組中miRNA-200a、miRNA-429表達(dá)量明顯高于正常對照組(P<

8、0.01);模型6周組中、miRNA200c、miRNA-141mRNA表達(dá)量明顯高于正常對照組(P<0.01);模型8周組中miRNA-200所有成員表達(dá)量皆明顯高于正常對照組(P<0.01),模型6周、8周大鼠肝臟組織中ZEB1與ZEB2蛋白(P<0.01)及mRNA(P<0.01)表達(dá)量皆明顯高于正常對照組。丹芍化纖膠囊干預(yù)4周、8周組大鼠肝組織E-cadherin、α-SMA、ZEB1/ZEB2表達(dá)與同期模型組存在顯著性差異(P

9、<0.05);干預(yù)8周組大鼠肝組織內(nèi)miR-200表達(dá)顯著低于8周模型組(P<0.01)。
　　結(jié)論:EMT參與并促進(jìn)了肝纖維化的發(fā)生發(fā)展;肝纖維化形成過程中EMT的發(fā)生可能是通過miRNA200s與ZEB1/ZEB2表達(dá)變化調(diào)節(jié)的;在丹芍化纖膠囊抑制肝纖維化發(fā)展過程中EMT的作用有所減輕;miRNA-200s與ZEB1/ZEB2可能是丹芍化纖膠囊抗肝纖維化作用的新靶點(diǎn)。
　　第二部分:TFG-β1誘導(dǎo)肝細(xì)胞EMT過程中ZE

10、B1/ZEB2及其調(diào)節(jié)因子miRNA200s表達(dá)的變化
　　目的:構(gòu)建轉(zhuǎn)化生長因子1(TFG-β1)誘導(dǎo)大鼠肝細(xì)胞發(fā)生EMT的模型,并觀察miRNA200s及其調(diào)節(jié)因子ZEB1/ZEB2表達(dá)變化情況。
　　方法:將大鼠肝細(xì)胞系BRL-3A細(xì)胞分為TGF-β1處理組和對照組,分別給予和不給予TGF-β1(6ng/ml)共培養(yǎng),收集各組培養(yǎng)0h、24h、48h、72h等量細(xì)胞,采用實時熒光定量PCR方法檢測miRNA-200s的

11、表達(dá)變化;采用實時熒光定量PCR法、細(xì)胞免疫熒光法、免疫印跡法(westernblotting)從基因及蛋白水平檢測E鈣粘結(jié)蛋白(E-cadherin)、平滑肌α肌動蛋白(α-SMA)、ZEB1與ZEB2的動態(tài)表達(dá)變化。
　　結(jié)果:TGF-β1處理組培養(yǎng)24h細(xì)胞較對照組miRNA-200a、miRNA-141的表達(dá)量明顯減少(P<0.05);處理組培養(yǎng)48h細(xì)胞miRNA-200a、miRNA-200b、miRNA-200c、m

12、iRNA-141的表達(dá)量明顯減少(P<0.05);處理組培養(yǎng)72h細(xì)胞miRNA-200a、miRNA-200b、miRNA-200c、miRNA-141表達(dá)量明顯減少(P<0.01);TGF-β1處理組培養(yǎng)24h、48h、72h細(xì)胞E-cadherin蛋白及mRNA表達(dá)量均較對照組細(xì)胞表達(dá)明顯減少(P<0.05),且成逐漸減少的趨勢;而α-SMA在各個時間點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)均未見明顯表達(dá);TGF-β1處理組培養(yǎng)24h、48h、72h細(xì)胞較對照組

13、ZEB1蛋白及mRNA表達(dá)量均明顯增加(P<0.01),處理組培養(yǎng)48h、72h細(xì)胞較對照組ZEB2蛋白及mRNA表達(dá)量均明顯增加(P<0.05)。
　　結(jié)論:TGF-β1可誘導(dǎo)大鼠肝細(xì)胞上皮極性消失,促進(jìn)肝細(xì)胞EMT的發(fā)生;miRNA-200a、miRNA-200b、miRNA-200c、miRNA-141在TGF-β1誘導(dǎo)肝細(xì)胞EMT的過程中表達(dá)下調(diào);TGF-β1誘導(dǎo)肝細(xì)胞EMT過程中ZEB1/ZEB2表達(dá)增加可能是通過TGF