高濃度皮質(zhì)醇介導慢性心理應激和動脈粥樣硬化的炎癥機制研究.pdf

1、背景: 心血管疾病是嚴重威脅人類生命健康的常見病和多發(fā)病。其危險因素有很多，如高脂血癥、高血壓、糖尿病、肥胖、吸煙等。但流行病學研究表明：大約40％的動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）的病人與上述危險因素無關(guān)，而與慢性心理應激密切相關(guān)。與AS相關(guān)的心理應激主要有負性情感、焦慮情緒、工作緊張等諸多心理社會應激。因此，進行心理應激與AS的相關(guān)研究在AS的預防和治療中具有深遠的意義。 目前，AS的發(fā)病機制有三種比較公

2、認的學說，即脂質(zhì)浸潤學說、血栓形成學說和內(nèi)皮損傷反應學說。國內(nèi)外已有不少關(guān)于慢性心理應激與這三種學說的相關(guān)關(guān)系的研究，但迄今為止，這些研究都無法清楚地解釋慢性心理應激是如何影響AS的發(fā)生、發(fā)展、結(jié)局。因此，這個領(lǐng)域期待著新的思路。近年來，炎癥學說在AS的發(fā)病機制中越來越重要。這個學說認為：AS是發(fā)生在動脈壁上的慢性炎癥反應，AS每一步特征性的損害代表著慢性炎癥反應的不同階段。而長期慢性心理應激不僅降低了內(nèi)源性抗炎物質(zhì)--皮質(zhì)醇的抗炎效果

3、，而且還擴大了炎癥反應，從而促進了動脈壁的損傷。 然而，高濃度的皮質(zhì)醇是通過促進了哪些炎癥因子的分泌，進而加速了AS的發(fā)生發(fā)展呢？此外，在心理應激導致AS的不同階段，這些炎癥因子的濃度變化趨勢是怎樣的？要研究這些問題，首先要建立慢性心理應激誘發(fā)AS的動物模型。建立這種模型需要滿足兩個條件：首先要有出現(xiàn)動脈粥樣硬化病灶的可能性，其次要可操作性強，能便于動態(tài)觀察動物的行為變化。但目前還沒有成熟的動物模型。 因此，需要建立與人

4、類慢性心理應激病變特征相似的慢性心理應激動物模型，并檢測其血清中與AS密切相關(guān)的炎性因子單核細胞趨化蛋白-1（monocte chemoattractant protein-1，MCP-1），巨噬細胞遷移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor， MIF），腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-alpha， TNF-α）和C-反應蛋白（C-reactive protein

5、， CRP）等的水平，觀察這些炎癥因子在心理應激導致AS的不同階段的濃度變化趨勢，以及這種變化趨勢是否與高濃度的皮質(zhì)醇密切相關(guān)。 目的: （1）建立與人類長期慢性心理應激病變特征相似，易于動態(tài)觀察慢性心理應激對動脈粥樣硬化影響的動物模型。 （2）比較心理應激誘導的AS和高脂飲食誘導的AS不同階段的炎癥因子濃度變化趨勢。 （3）篩選出既與皮質(zhì)醇濃度變化密切相關(guān)，又與AS密切相關(guān)的炎性因子。 方法:

6、 1.實驗分組。 健康雄性純種新西蘭大白兔160只，隨機分為正常對照組（A組）、高脂組（B組）、慢性心理應激組（C組）和高脂加慢性心理應激組（D組）各40只。A組、C組給予普通顆粒飼料喂養(yǎng)，B組、D組給予含1％膽固醇的高脂飼料喂養(yǎng)。實驗周期為16周。 2.動物模型的建立。 對C組和D組的80只實驗兔進行慢性不可預見性心理應激：第一天噪音刺激3h，第二天旋轉(zhuǎn)60 min（80轉(zhuǎn)/min），第三天狗驚嚇60 min（

7、在一個放狗的大籠子里加一道柵欄，將其一分為二，狗不能鉆過柵欄，一邊放狗，一邊放兔子），第四天把兔子放進塑料網(wǎng)兜懸掛4h，第五天足底電擊60 min（110 v，1次/min），第六天斷水24 h，第七天斷食24 h，以七天為一個周期，下一個周期在上一個周期的基礎(chǔ)上增加10 min。實驗周期共為16周。 3.動物模型的評價。 （1）于實驗前和實驗后每4周分別記錄所有實驗兔飲食量，體重，血壓，心率，血清皮質(zhì)醇和炎癥因子的水平

8、。 （2）于實驗前和實驗結(jié)束后，觀察并記錄所有實驗兔自我修飾行為的變化。 4.血脂檢測。 分別于實驗開始、4周、8周、12周及16周末采血做血液生化檢查。采用酶聯(lián)法測定血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）及高密度脂蛋白膽固醇（high-densit

9、ylipoprotein cholesterol， HDL-C）水平。 5.血清皮質(zhì)醇及炎性因子的檢測。 分別于實驗開始、4周、8周、12周及16周末采血，應用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA）檢測血清皮質(zhì)醇（corticosterone，CORT）、高敏C反應蛋白（high sensitivity C-reactrve protein， hs-CRP）和腫瘤壞

10、死因子-α（TNF-α）的水平。 6.高頻體表超聲檢查。 分別于實驗開始、8周末、12周末、24周末行腹主動脈高頻體表超聲檢查。測量動脈舒張末期內(nèi)徑（end-diastolic luminal diameter，Dd）、動脈收縮末期內(nèi)徑（end-systolic luminal diameter， Ds）、腹主動脈后壁內(nèi)膜.中層厚度（Intima-Media Thickness，IMT）、腹主動脈收縮期血流峰值速度（pe

11、ak velocity，Vp）、收縮期平均速度（mean velocity， Vm）和收縮期流速積分（velocity integral，VTI）。將內(nèi)-中膜平均回聲強度AⅡ-Ⅰ與外膜平均回聲強度AⅡ-A的比值作為內(nèi)-中膜校正的AD值（AⅡc％），AⅡc％=AⅡ-Ⅰ/（AⅡ-A）×100％。 7.病理染色。 留取腹主動脈標本，蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，油紅O（red-oil O）染色。

12、 8.免疫組織化學染色。 行TNF-α、MIF、ET-1、CRP、eNOS、MCP-1及IL-10免疫組織化學染色。 9.Real-time PCR。 檢測血管組織中TNF-α、ET-1、CRP、eNOS、MCP-1及IL-10的mRNA表達水平，并以管家基因GAPDH作為參照。 10.Western blot。 檢測血管組織中TNF-α、ET-1、CRP、eNOS、MCP-1及IL-10

13、的蛋白表達水平。 11.統(tǒng)計學分析。 連續(xù)性數(shù)據(jù)用x±SD表示，離散數(shù)據(jù)用例數(shù)和百分數(shù)表示。組內(nèi)比較服從正態(tài)分布的資料采用t檢驗，非正態(tài)分布資料采用秩和檢驗，組間差異性比較采用單因素方差分析，應用SPSS統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理（version 13.0； SPSS Inc），P<0.05有統(tǒng)計學差異。 結(jié)論: （1）建立了與人類長期慢性心理應激病變特征相似，易于觀察慢性心理應激對動脈粥樣硬化影響的動物模型。