心室起搏誘導(dǎo)心肌適應(yīng)減輕急性心梗后再灌注損傷的研究.pdf

1、急性心肌梗死后梗死面積與梗死后心律失常、心力衰竭和死亡率明顯相關(guān)，因此，急性心肌梗死治療中減少心梗面積是重要的治療目標(biāo)。早期再灌注治療是挽救心肌，減少心梗面積的有效方法。但再灌注治療本身會導(dǎo)致心肌細(xì)胞的死亡和心肌收縮力的下降，對缺血心肌造成再次損傷。因此有效抑制或減輕再灌注損傷，可以進(jìn)一步提高再灌注治療的療效，減少臨床并發(fā)癥，并進(jìn)一步降低急性心梗死亡率。
　　缺血適應(yīng)定義為在心肌發(fā)生嚴(yán)重缺血之前、之后和缺血的同時給予心肌或其他臟器

2、間斷重復(fù)的再次缺血，可減輕再灌注的損傷，即缺血預(yù)適應(yīng)、后適應(yīng)、過程適應(yīng)和遠(yuǎn)程適應(yīng)具有保護(hù)再灌注損傷的作用。近年一個荷蘭研究小組報道了心室起搏引起的心室收縮不同步在兔心和豬心也同樣具有預(yù)適應(yīng)和后適應(yīng)的作用。
　　我們的研究首先利用Metronic Select Secure3830主動起搏電極和心房超速抑制起搏模式在新西蘭兔和SD大鼠上成功建立在體右室心尖部起搏模型，并通過心電生理和心超證實了左室收縮的不同步。其次，我們以心室起搏3

3、0秒，間歇30秒作為一個起搏周期，分別在兔心和大鼠心上證實了右室心尖部20周期起搏預(yù)適應(yīng)、10、20周期過程適應(yīng)和20周期后適應(yīng)能減輕Evans藍(lán)和TTC雙染色的心梗面積，其中20周期起搏預(yù)適應(yīng)效果最佳，20周期過程適應(yīng)優(yōu)于10周期過程適應(yīng)，而且發(fā)現(xiàn)起搏適應(yīng)在減少心梗面積的同時伴相應(yīng)心肌細(xì)胞凋亡率的下降。之后我們通過ELISA、Western印跡、qPCR等分子生物學(xué)技術(shù)，證實起搏誘導(dǎo)適應(yīng)的分子水平機制為牽張作用下調(diào)PKC信號通路，降低

4、炎癥因子的表達(dá)，減少心肌細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而減少再灌注損傷。最后我們又在SD大鼠模型上發(fā)現(xiàn)起搏誘導(dǎo)的預(yù)適應(yīng)、過程適應(yīng)和后適應(yīng)能減少心梗后長期（8周）的心肌纖維化、左室擴大和左室收縮功能的下降，并證實這一保護(hù)作用是通過下調(diào)AT1R-PKC-ERK信號通路，降低心肌纖維化，抑制心肌重構(gòu)而改善左心收縮功能。
　　綜合以上研究成果，我們認(rèn)為右心室心尖部起搏誘導(dǎo)的心室收縮不同步，能夠在新西蘭兔和SD大鼠兩種動物模型上產(chǎn)生預(yù)適應(yīng)、過程適應(yīng)和后適應(yīng)

5、作用來保護(hù)心肌梗死后的再灌注損傷，其作用機制是通過牽張作用下調(diào)PKC信號通路，降低炎癥因子的表達(dá)，減少心肌細(xì)胞的凋亡來實現(xiàn)，另外，起搏誘導(dǎo)的適應(yīng)能通過下調(diào)AT1R-PKC-ERK信號通路，減少心梗后長期的心肌纖維化，抑制心肌重構(gòu)而改善左心收縮功能。因此PKC信號通路可能在起搏誘導(dǎo)適應(yīng)減少心肌細(xì)胞凋亡和心肌纖維化兩方面都發(fā)揮重要作用。
　　第一部分建立急性心肌梗死和再灌注損傷模型和在體右心室起搏模型
　　目的:在新西蘭兔和SD

6、大鼠建立可靠的左室心梗和再灌注損傷和在體右心室心尖部起搏模型。
　　方法:采用開胸結(jié)扎冠狀動脈的方法分別在新西蘭兔和SD大鼠建立左室心梗模型;12導(dǎo)聯(lián)心電圖檢測新西蘭兔和SD大鼠的心電活動;以30％硫酸鋇主動脈逆行灌流離體SD大鼠心臟，活體成像系統(tǒng)X線攝片;Select Secure3830主動起搏電極旋入新西蘭兔或SD大鼠右室心尖部后與Metronic2090程控儀+2290分析儀相連接，以VOO模式高于自身心率20次/分奪獲自

7、身節(jié)律，建立在體右室心尖起搏模型，測量比較起搏前后QRS波群寬度，并在新西蘭兔關(guān)胸后比較起搏前后經(jīng)胸心超測量室間隔及左室后壁達(dá)最大收縮時間差異(SPWMD)和左室（右室）射血前時間間期(PEP)以及經(jīng)頸動脈插入導(dǎo)管進(jìn)入左心室測量左室壓力和dp/dt的變化。
　　結(jié)果:分別開胸在新西蘭兔結(jié)扎左室支和在SD大鼠結(jié)扎前降支，12導(dǎo)聯(lián)心電圖可以看到ST-T動態(tài)改變和再灌注心律失常;成功獲得SD大鼠冠狀動脈造影圖像，包括成功結(jié)扎前降支圖像;

8、分別在新西蘭兔和SD大鼠建立在體右室心尖部起搏模型，起搏后QRS波明顯較起搏前增寬;新西蘭兔起搏前后比較SPWMD和PEP，結(jié)果SPWMD起搏前(20.02±8.32)ms vs起搏后(78.80±26.57)(P=0.007，n=5); PEP起搏前(14.40±5.86)ms，起搏后(-26.80±7.33)(P＜0.001);有創(chuàng)測定最大dp/dt起搏前(1072.82±154.85)mmHg/ms，起搏后(648.75±135.

9、09)mmHg/ms(P＜0.001)，最小dp/dt起搏前(-989.49±100.51)mmHg/ms vs起搏后(-547.57±148.11)mmHg/ms(P=0.002)。
　　結(jié)論:結(jié)扎方式建立的新西蘭兔和SD大鼠急性心梗和再灌注損傷模型是可靠的;以Select Secure3830主動起搏電極建立的右室心尖部起搏模型是可靠的，心電生理和心超證實右室心尖部起搏存在左右心室和左室內(nèi)收縮不同步，影響左室的收縮功能。

10、>　　第二部分心室收縮不同步誘導(dǎo)的心肌適應(yīng)減輕兔急性心肌梗死后短期再灌注損傷的研究
　　目的:探討右室心尖部起搏造成的心室收縮不同步誘導(dǎo)的不同形式心肌適應(yīng)能否減輕新西蘭兔缺血再灌注心肌損傷。
　　方法:新西蘭兔開胸結(jié)扎左室支30分鐘后再灌注210分鐘建立急性心梗再灌注損傷模型，右室心尖部旋入Select Secure3830主動起搏電極，60只新西蘭兔分成5組，分別為假起搏組:不予起搏;過程適應(yīng)10(Per10)組:左室支結(jié)

11、扎20分鐘后，以基礎(chǔ)自身心率加20次/分作為起搏頻率，10個30秒起搏周期，每個間隔30秒，之后松解結(jié)扎再灌注;后適應(yīng)20(Post20)組:結(jié)扎30分鐘后松解結(jié)扎即刻起搏20個周期后再灌注;過程適應(yīng)20(Per20)組:結(jié)扎10分鐘后起搏20個周期，之后松解再灌注;預(yù)適應(yīng)20(Pre20)組:20個起搏后立即結(jié)扎左室支，30分鐘后松解結(jié)扎再灌注。分別靜脈取血測定開胸前和再灌注結(jié)束取材前的CK-MB，TNT、LDH、CRP、TNF-α、

12、IFN-γ和IL-10。每組6-9只行Evans藍(lán)和TTC雙染色測定并計算梗死比值和缺血比值，每組另取5只取材后浸泡于10％福爾馬林液固定，切片行HE染色、免疫組化Connexin43表達(dá)和TUNEL測定凋亡細(xì)胞比值。
　　結(jié)果:
　　1.5組的心臟比值和缺血百分比組間無差異。5組的梗死百分比組間有差異（x2值83.85，P值＜0.001），其中假起搏組(n=9)的梗死百分比最高達(dá)61.23％,干預(yù)組中Pre20組(n=7)

13、和Per20組(n=6)梗死百分比最低，分別42.46％和41.03％，兩組間統(tǒng)計學(xué)無差異，Post20組(n=7)梗死百分比為47.87％，高于Pre20組和Per20組但低于Per10組(n=6)50.90％, Per10組梗死百分比高于Per20組，均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　2.5組的血清心肌酶，與基線相比較，包括血清CKMB、TNT和LDH水平，在左室支結(jié)扎30分鐘再灌注210分鐘后均明顯升高，無論給予何種形式的起搏誘導(dǎo)的適應(yīng)

14、均降低再灌注后的心肌酶濃度，而Per20組和Pre20組更明顯。
　　3.心肌細(xì)胞凋亡率在5組組間存在統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.001，在假起搏組達(dá)到82.42％，凋亡率最高，其次是Per10組和Post20組，分別是68.93％和69.04％，這兩組間無統(tǒng)計學(xué)差異，Per20組和Pre20組最低，分別為62.85％和58.88％，兩組間無統(tǒng)計學(xué)差異，但與其他三組間有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　4.各組在左室支結(jié)扎30分鐘再灌注210分鐘后

15、血清CRP、TNF-α、IL-10和IFN吖水平與基線相比均增高，與假起搏組相比，Per10組各炎性指標(biāo)無差異，Post20組減輕TNF-α和IFN-7水平，Per20組和Pre20組減輕CRP、TNF-α、IL-10和IFN-γ水平。
　　結(jié)論:
　　1.右心室心尖部起搏誘導(dǎo)的心肌適應(yīng)，包括預(yù)適應(yīng)、過程適應(yīng)和后適應(yīng)均能減輕缺血再灌注心肌損傷;在所有這些起搏誘導(dǎo)適應(yīng)的模式中，預(yù)適應(yīng)減輕缺血再灌注心肌損傷的程度最明顯，過程適應(yīng)

16、和后適應(yīng)次之;20周期過程適應(yīng)優(yōu)于10周期過程適應(yīng)，與預(yù)適應(yīng)效果類似。
　　2.起搏誘導(dǎo)的心肌適應(yīng)使兔急性心肌梗死240分鐘后心肌細(xì)胞的凋亡率明顯下降，其中預(yù)適應(yīng)和20周期的過程適應(yīng)最明顯，同時使包括CRP、TNF-α、IL-10和IFN-γ血清炎性因子水平也明顯下降。
　　3.起搏誘導(dǎo)的心肌適應(yīng)作用可能是通過減少再灌注時炎性因子造成心肌細(xì)胞的凋亡來實現(xiàn)降低再灌注心肌損傷。
　　第三部分心室收縮不同步誘導(dǎo)的心肌適應(yīng)減輕

17、大鼠急性心肌梗死后再灌注損傷短期作用和機制的研究
　　目的:探討右室心尖部起搏誘導(dǎo)的心肌適應(yīng)減輕大鼠急性心肌梗死后再灌注損傷短期作用和起搏適應(yīng)的機制。
　　方法:SD大鼠開胸結(jié)扎前降支30分鐘后再灌注90分鐘建立急性心梗再灌注損傷模型，右室心尖部旋入Select Secure3830主動起搏電極。分成5組，分別為假起搏組:不予起搏;過程適應(yīng)10(Per10)組:前降支結(jié)扎20分鐘后，以基礎(chǔ)自身心率加20次/分作為起搏頻率，1

18、0個30秒起搏周期，每個間隔30秒，之后松解結(jié)扎再灌注;后適應(yīng)20(Post20)組:結(jié)扎30分鐘后松解結(jié)扎即刻起搏20個周期后再灌注;過程適應(yīng)20(Per20)組:結(jié)扎10分鐘后起搏20個周期，之后松解再灌注;預(yù)適應(yīng)20(Pre20)組:20個起搏后立即結(jié)扎前降支，30分鐘后松解結(jié)扎再灌注。分別靜脈取血測定開胸前和再灌注結(jié)束取材前的CK-MB，TNT、LDH、CRP、TNF-、IFN-和IL-10。行Evans藍(lán)和TTC雙染色測量并計

19、算梗死比值和缺血比值，另取每組5只行組織切片HE染色、免疫組化Connexin43表達(dá)和TUNEL測定凋亡細(xì)胞比值;抽取心肌組織RNA，檢測IL12a、IL6R、IL8Ra和IL8Rb四個炎癥相關(guān)基因以及FOS、HSP ala和TGF beta1三個炎癥因子轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)基因的表達(dá);Western Blot法檢測1.心肌組織PKC通路蛋白各亞型(pPKC、pPKC1、pPKC2和pPKC)與ERK的蛋白表達(dá)水平;2.反映炎癥活性程度的pI

20、 B和pNF B及細(xì)胞內(nèi)總I B和NF B的蛋白表達(dá)水平、3.AKT家族、Bcl-2家族和Survivin凋亡信號通路相關(guān)蛋白和Caspase3的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.5組的心臟比值和缺血百分比組間無差異。5組的梗死百分比組間有差異（x2值=52.40，P值＜0.001），其中假起搏組(n=7)的梗死百分比最高達(dá)48.21％，干預(yù)組中Per10組(n=6)、Post20組(n=7)、Per20組(n=6)和Pre2

21、0組(n=7)梗死百分比為分別37.07％、43.53％、27.71％和22.66％，組間均有統(tǒng)計學(xué)差異，Pre20組的梗死百分比最低。
　　2.5組的血清心肌酶，與基線相比較，包括血清CKMB、TNT和LDH水平，在前降支結(jié)扎30分鐘再灌注90分鐘后均明顯升高，無論給予何種形式的起搏誘導(dǎo)的適應(yīng)均降低心梗后的心肌酶濃度，而Per20組最明顯。
　　3.心肌細(xì)胞凋亡率在5組組間存在統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.001，在假起搏組達(dá)到58

22、.92％，凋亡率最高，其次是Per10組和Post20組，分別是48.83％和49.57％，這兩組間無統(tǒng)計學(xué)差異，Per20組和Pre20組最低，分別為40.73％和40.11％，兩組間無統(tǒng)計學(xué)差異，但與其他三組間有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　4.各組在左室支結(jié)扎30分鐘再灌注210分鐘后血清CRP、TNF-α、IL-10和IFN-γ水平與基線相比均增高，與假起搏組相比，各干預(yù)組的炎性因子均有下降，統(tǒng)計學(xué)有差異，其中Pre20組所有炎性因子

23、水平下降幅度最大。
　　5.Connexin43表達(dá)在假起搏組出現(xiàn)明顯紊亂，團塊狀聚集。而起搏干預(yù)組Cx43的分布紊亂程度減輕，其中Pre20組則更接近于正常的密度，呈短條帶狀分布于心肌細(xì)胞閏盤部位。
　　6.起搏干預(yù)明顯降低PKC各亞型的表達(dá)活性，并下調(diào)磷酸化ERK表達(dá)，其中Pre組表達(dá)降低最為明顯(P＜0.05)
　　7.心肌適應(yīng)干預(yù)組炎癥因子IL12a、IL6R、IL8Ra和IL8Rb的表達(dá)均顯著下調(diào)，進(jìn)而三個轉(zhuǎn)

24、錄水平相關(guān)基因FOS、HSP ala和TGF beta1表達(dá)也顯著下調(diào)。同時，炎癥相關(guān)蛋白pI B和pNFB表達(dá)明顯下調(diào)，而細(xì)胞內(nèi)總I B和NF B的量保持恒定水平。
　　8.干預(yù)組pAKT/AKT、Bcl-2/Bax和Survivin凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)顯著升高，Caspase3的表達(dá)水平明顯下調(diào)，其中表現(xiàn)最明顯的是Pre20組，其次是Per20組。
　　結(jié)論:
　　1.右心室心尖部起搏誘導(dǎo)的心肌適應(yīng)，包括預(yù)適應(yīng)、過程

25、適應(yīng)和后適應(yīng)均能減輕SD大鼠急性心肌梗死后再灌注心肌損傷;在所有這些起搏誘導(dǎo)適應(yīng)的模式中，預(yù)適應(yīng)減輕缺血再灌注心肌損傷的程度最明顯，過程適應(yīng)和后適應(yīng)次之;20周期過程適應(yīng)優(yōu)于10周期過程適應(yīng)，與預(yù)適應(yīng)效果類似。
　　2.起搏誘導(dǎo)的心肌適應(yīng)在分子水平是通過激活PKC信號通路，降低炎癥因子的表達(dá)，減少心肌細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而減少再灌注損傷;另外也通過調(diào)控Connexin43的表達(dá)減少心肌細(xì)胞的凋亡從而起到保護(hù)作用。
　　第四部分起搏

26、誘導(dǎo)的心肌適應(yīng)減輕大鼠急性心肌梗死后再灌注損傷長期效果的研究
　　目的:探討起搏誘導(dǎo)的心肌適應(yīng)減輕大鼠急性心肌梗死后再灌注損傷的長期效果。
　　方法:SD大鼠開胸結(jié)扎前降支30分鐘后再灌注90分鐘建立急性心梗再灌注損傷模型，右室心尖部旋入Select Secure3830主動起搏電極。分成4組，分別為假起搏組:不予起搏;過程適應(yīng)20(Per20)組:結(jié)扎10分鐘后以基礎(chǔ)自身心率加20次/分作為起搏頻率，20個30秒起搏周期，

27、每個間隔30秒起搏，之后松解再灌注;后適應(yīng)20(Post20)組:結(jié)扎30分鐘后松解結(jié)扎再灌注即刻，起搏20個周期;預(yù)適應(yīng)20(Pre20)組:20個起搏后立即結(jié)扎前降支，30分鐘后松解結(jié)扎再灌注。在開胸前和術(shù)后8周行經(jīng)胸超聲心動圖，M型超聲(M-mode)左側(cè)胸骨旁長軸切面圖像，測量左室舒張期前壁厚度(Left ventricular anterior wall(diastole)，LVAWd)、左室舒張期后壁厚度(Left vent

28、ricular posterior wall(diastole)，LVPWd)、左室舒張期內(nèi)徑(Left ventricular internal diameter(diastole)，LVIDd)、左室射血分?jǐn)?shù)(LV ejection fraction％，LVEF％)和左室縮短分?jǐn)?shù)(LV FractionalShortening％，LVFS％)。8周后組織切片HE染色測定并計算質(zhì)核比比值，Masson染色測量并計算心肌纖維化百分比;W

29、estern印跡法檢測心肌組織PKC通路蛋白各亞型(pPKC、pPKC1、pPKC2和pPKC)、心肌細(xì)胞膜血管緊張素Ⅱ-1型受體(AT1R)和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:通過心臟超聲檢測，發(fā)現(xiàn)缺血再灌注損傷長期（8周）干預(yù)組心功能出現(xiàn)明顯改善，LVEF％和FS％顯著升高，LVAWd和LVPWd厚度增加較假起搏組明顯好轉(zhuǎn)，LVIDd擴張較假起搏組明顯降低。反映心肌纖維化程度的Masson染色提示心肌適應(yīng)

30、干預(yù)組心肌纖維化百分比較假起搏組明顯減少。HE染色發(fā)現(xiàn)，與假起搏組相比，干預(yù)組心肌細(xì)胞質(zhì)核比比值明顯降低。WeStern印跡法證實起搏誘導(dǎo)的適應(yīng)使介導(dǎo)心肌肥厚的信號蛋白AT1R表達(dá)水平明顯下調(diào)(P＜0.01)，其下游的PKC各亞型磷酸化活性形式(pPKC、pPKC1、pPKC2和pPKC)蛋白水平也下調(diào)(P＜0.001)，進(jìn)而ERK活性形式pERK的表達(dá)水平也下調(diào)(P＜0.001)。
　　結(jié)論:起搏誘導(dǎo)的20起搏周期預(yù)適應(yīng)、過程適

31、應(yīng)和后適應(yīng)均能減輕SD大鼠急性心肌梗死后8周心肌纖維化，減少左室壁增厚、左室擴大和左室收縮功能的下降。
　　起搏誘導(dǎo)的心肌適應(yīng)在大鼠缺血再灌注損傷晚期通過下調(diào)AT1R表達(dá)水平，繼而下調(diào)PKC信號通路蛋白表達(dá)活性，降低ERK活性形式的表達(dá)，從而降低心肌纖維化程度，一定程度抑制心肌重構(gòu)，而達(dá)到改善心功能的作用。
　　結(jié)論
　　1.在新西蘭兔和SD大鼠上建立急性前壁心梗和右室心尖部起搏在體模型是可靠;
　　2.右室心尖

32、部起搏誘導(dǎo)的預(yù)適應(yīng)、過程適應(yīng)和后適應(yīng)能減輕缺血再灌注損傷;
　　3.起搏誘導(dǎo)適應(yīng)的分子水平機制為牽張作用下調(diào)PKC信號通路，降低炎癥因子表達(dá)，減少心肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而減少再灌注損傷;
　　4.起搏誘導(dǎo)的預(yù)適應(yīng)、過程適應(yīng)和后適應(yīng)能減少心梗后長期的心肌纖維化、左室擴大和左室收縮功能的下降;
　　5.起搏誘導(dǎo)的適應(yīng)對缺血再灌注損傷的保護(hù)作用是通過下調(diào)AT1R-PKC-ERK信號通路，降低心肌纖維化，抑制心肌重構(gòu)而改善左心收縮功

33、能。
　　創(chuàng)新點和研究意義：
　　1.首次發(fā)現(xiàn)右室心尖部起搏誘導(dǎo)的過程適應(yīng)對缺血再灌注損傷保護(hù)作用的存在;
　　2.首次在SD大鼠上建立了右室心尖部起搏的在體模型并證實起搏誘導(dǎo)的預(yù)適應(yīng)、過程適應(yīng)和后適應(yīng)均能保護(hù)缺血再灌注損傷;
　　3.發(fā)現(xiàn)起搏誘導(dǎo)的適應(yīng)分子水平機制為牽張作用激活PKC信號通路，降低炎癥因子的表達(dá)，減少心肌細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而減少再灌注損傷，為不同形式適應(yīng)的機制提供了新的理論依據(jù);
　　4.更進(jìn)