多重呼吸道病原體分子檢測(cè)體系的臨床應(yīng)用及不同血清型腺病毒與兒童重癥肺炎的關(guān)系.pdf

1、研究背景：
　　急性呼吸道感染（Acute respiratory tract infection，ARTI）在各年齡段兒童中是一種常見(jiàn)疾病，尤其在小于5歲兒童中常見(jiàn)。ARTI癥狀輕者可表現(xiàn)為扁桃體炎，較嚴(yán)重者可因重癥肺炎及其并發(fā)癥導(dǎo)致死亡，其高住院率及死亡率為社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。急性呼吸道感染的主要病原體，以呼吸道病毒為主，呼吸道病原體混合感染在兒童ARTI中的檢出率在30％至50%不等，準(zhǔn)確地檢測(cè)呼吸道感染的病原體，對(duì)于臨床合理

2、用藥治療具有重要意義。目前，臨床實(shí)驗(yàn)室主要采用熒光定量PCR（ Realtime quantitative PCR，qPCR）方法，人工提取核酸耗時(shí)較長(zhǎng)且無(wú)法在一次反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)多達(dá)十余種病原體。隨著多重PCR技術(shù)的成熟，市面上逐漸出現(xiàn)商品化的多重PCR檢測(cè)體系，如Filmarray呼吸道病原體檢測(cè)平臺(tái)，是基于巢式多重qPCR方法的呼吸道病原體快速檢測(cè)平臺(tái)，可在70分鐘內(nèi)于密閉反應(yīng)條中自動(dòng)完成核酸提取、逆轉(zhuǎn)錄、qPCR步驟，檢測(cè)1份樣本

3、中18種呼吸道病原體，雖其成本較高，但具有不依賴PCR實(shí)驗(yàn)室條件、快速、病原譜廣的優(yōu)點(diǎn)，適合應(yīng)用于門(mén)診的急重癥患者；海爾施呼吸道病原體多重檢測(cè)體系，是基于多重PCR及毛細(xì)管電泳分離法的檢測(cè)體系，依賴于PCR實(shí)驗(yàn)室條件及人工操作，在一次反應(yīng)中可同時(shí)對(duì)180份樣本完成共14種常見(jiàn)呼吸道病原體的檢測(cè)，具有通量大、成本低的特點(diǎn)。這些多重PCR檢測(cè)體系，都有助于實(shí)現(xiàn)臨床實(shí)驗(yàn)室在短時(shí)間內(nèi)完成對(duì)多種呼吸道病原體的檢測(cè)，但尚未獲得CFDA認(rèn)證，需開(kāi)展臨

4、床應(yīng)用及評(píng)估，以盡快投入臨床檢測(cè)中使用。
　　腺病毒（Adenovirus，ADV）作為一種兒童急性呼吸道感染常見(jiàn)病原體，在各地區(qū)ARTI兒童中的檢出率由5%至25%不等，且主要在5歲以下兒童檢出。有研究發(fā)現(xiàn)，從重癥肺炎患兒中分離的腺病毒較多見(jiàn)的為7型腺病毒（ADV-7），推斷ADV-7與兒童重癥肺炎有密切關(guān)系，然而，對(duì)不同血清型腺病毒引起的臨床癥狀作系統(tǒng)、大量數(shù)據(jù)分析的研究仍然較少見(jiàn)，且研究入組例數(shù)較少，不足以明確ADV-7較其

5、余血清型更易引起兒童重癥肺炎，ADV-7在重癥肺炎中的致病機(jī)制尚未明確。
　　研究目的：
　　1.評(píng)估多重呼吸道病原體分子檢測(cè)體系的臨床應(yīng)用，旨在為臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室針對(duì)不同需求的患者應(yīng)用快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法提供參考。
　　2.通過(guò)調(diào)查呼吸道感染住院兒童中常見(jiàn)病原體的流行情況、混合感染檢出率及混合感染與疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系，在兒童ARTI病因?qū)W方面為臨床提供參考；探討上呼吸道、下呼吸道樣本中檢出病原體的相關(guān)性，為臨床采樣方法

6、的選擇提供科學(xué)依據(jù)。
　　3.探討各血清型腺病毒在呼吸道感染住院兒童中的流行情況、不同血清型與患兒臨床病情發(fā)展的相關(guān)性，明確重癥患者腺病毒基因組特征，為腺病毒致病機(jī)制的研究提供流行病學(xué)資料。
　　研究方法：
　　1.建立分別針對(duì)常見(jiàn)呼吸道病原體的檢測(cè)體系，包括甲型流感病毒（Influenza A virus，IFA）、乙型流感病毒（Influenza B virus，IFB）、1~4型人副流感病毒（Parainflue

7、nza virus，PIV），呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV）、腺病毒（Adenovirus，ADV）、鼻病毒（Rhinovirus，RV）、腸道病毒（Enterovirus，EV）、人偏肺病毒（Human metapneumovirus，HMPV）、冠狀病毒（Coronavirus， CoV）OC43，CoV NL63，CoV229E、CoV HKU1、肺炎支原體（ Mycoplasma

8、 pneumoniae，MP）、肺炎衣原體（Chlamydia pneumoniae，CP）、百日咳桿菌（Bordetella pertussis，BP）18種常見(jiàn)呼吸道病原體的自建熒光定量PCR（Realtime quantative PCR，qPCR）檢測(cè)體系，與基于巢式多重qPCR法的Filmarray，及基于多重PCR和毛細(xì)管電泳方法的海爾施14種呼吸道病原體多重檢測(cè)體系，共三種檢測(cè)體系，共同檢測(cè)55例診斷為急性呼吸道感染住院兒

9、童55份NPS及30份BALF中的病原體。比較三種檢測(cè)體系的結(jié)果，分析各病原體及混合感染的檢出率、混合感染與臨床特征的關(guān)系，并研究患兒上、下呼吸道樣本檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性。
　　2.對(duì)2014年6月至2016年8月期間廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院及廣州市婦女兒童醫(yī)院共240例住院患兒的腺病毒陽(yáng)性核酸樣本，以qPCR及一代測(cè)序方法進(jìn)行血清型分型，統(tǒng)計(jì)各血清型檢出率。收集所有患兒臨床特征資料，分析不同血清型ADV與ARTI患兒臨床特征的相關(guān)性。

10、
　　3.通過(guò)基于高通量測(cè)序技術(shù)的宏基因組學(xué)方法，獲得腺病毒感染重癥患者7型ADV全基因組序列，對(duì)ADV-7全基因組及各個(gè)主要功能基因作基因突變和進(jìn)化分析。
　　研究結(jié)果：
　　1.Filmarray共從41例（74.5%）ARTI住院患兒的NPS中檢出至少1種呼吸道病原體，混合感染的檢出率為40%（22/55）。RV為檢出率最高的病原體，其次為MP和RSV，RV與MP合并感染為最常見(jiàn)混合感染模式。單一病原體感染與混合

11、感染患兒的臨床特征差異未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。共76.7%患兒（23/30）NPS樣本中檢出的病原體可包括其BALF中檢出的病原體，53.3%（16/30）患兒NPS與BALF中檢出的病原體完全一致。通過(guò)Filmarray、海爾施、自建qPCR檢測(cè)體系均得到基本相符結(jié)果。Filmarray與自建qPCR檢測(cè)結(jié)果一致率達(dá)84.7%，海爾施與自建qPCR檢測(cè)結(jié)果一致率達(dá)75.4%。
　　2.3型腺病毒為2014年至2016年主要流行的腺病毒血

12、清型，占77.5%，其次為7型腺病毒，占20.4%。ADV-7感染患兒中2歲以下兒童比例高于ADV-3感染患兒，且 ADV-7感染患兒的肺炎、重癥肺炎、并發(fā)癥、胸腔積液、需機(jī)械輔助通氣發(fā)生率顯著高于ADV-3感染患兒（P＜0.01）。
　　3.通過(guò)高通量測(cè)序，組裝獲得1例重癥肺炎患者7型腺病毒全基因組序列，與基因數(shù)據(jù)庫(kù)中ADV-7基因組比較，未發(fā)現(xiàn)該例ADV-7存在大片段變異。通過(guò)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，ADV-7全基因組與2011年廣州地

13、區(qū)一例重癥死亡病例中分離的ADV-7同源性最高，ADV-7全基因組及Hexon、Fiber、E3區(qū)域基因與近年來(lái)中國(guó)地區(qū)ADV-7均有高度同源性。本研究 ADV-7全基因組與2011年廣州地區(qū)重癥死亡病例的ADV-7全基因組相比，在轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白55 kDa外顯子1發(fā)現(xiàn)一處C3218A堿基突變，為同義突變。
　　研究結(jié)論：
　　三種呼吸道病原體檢測(cè)體系的檢測(cè)結(jié)果相互之間基本相符，方便臨床為不同需求患者提供適宜的檢測(cè)體系。三種檢

14、測(cè)體系共同驗(yàn)證了混合感染在急性呼吸道感染住院患兒中有較高的檢出率，但與臨床特征的相關(guān)性需要進(jìn)一步研究。上、下呼吸道樣本中病原體有較高一致性，采集鼻咽拭子進(jìn)行檢測(cè)可一定程度預(yù)測(cè)下呼吸道病原體，有簡(jiǎn)便、無(wú)創(chuàng)的優(yōu)勢(shì)。3型腺病毒在2014年至2016年為主要流行血清型，而7型腺病毒與兒童重癥肺炎有密切關(guān)系。7型腺病毒全基因組及各主要功能基因均高度保守，未發(fā)生明顯突變。7型腺病毒并非通過(guò)突變引起兒童重癥肺炎，其在嗜性、復(fù)制能力、及引起宿主免疫反應(yīng)