大鼠—大鼠雜交瘤單克隆抗體技術的優(yōu)化及HIV病毒P24抗原特異性大鼠單抗的建立與應用.pdf

1、自上世紀60年代出現(xiàn)基于骨髓瘤的單克隆抗體制備技術以來，單克隆抗體在生物醫(yī)學領域已獲得廣泛應用，既可以作為研究工具，也可以應用于疾病的診斷與治療。最常見的單克隆抗體制備技術是基于小鼠-小鼠雜交瘤的小鼠單抗制備技術。近年來，隨著生物醫(yī)學的快速發(fā)展，小鼠單抗制備技術逐漸暴露出自身的局限性，如:對小鼠源抗原的反應性較弱、對部分人源抗原的抗體親和力較低等，因此，開發(fā)非小鼠種屬來源的新型單抗制備技術成為一個新的研究方向，包括基于大鼠-大鼠雜交瘤的

2、大鼠單抗制備技術、基于家兔雜交瘤技術的兔單抗制備技術等。本研究以大鼠單抗制備技術為研究對象，首先，通過優(yōu)化本實驗室前期建立的大鼠單抗制備方法，解決了影響大鼠單抗制備穩(wěn)定性的關鍵影響因素，建立起穩(wěn)定的大鼠單抗制備技術;然后，應用大鼠單抗技術研制針對HIV病毒衣殼蛋白(P24)的大鼠單抗;最后，探索抗-P24大鼠單抗在HIV診斷試劑開發(fā)中的應用潛能。具體研究結果如下:
　　 首先，優(yōu)化大鼠單抗制備技術。通過分析本實驗室前期建立的大鼠

3、-大鼠雜交瘤單抗制備技術存在的技術瓶頸問題，確定融合率、融合檢測方式、克隆化方式以及腹水誘導成功率等影響大鼠單抗技術推廣應用的關鍵問題作為首選的優(yōu)化對象。結果顯示:(1)膽固醇是影響大鼠-大鼠雜交瘤融合成功率的關鍵因素，通過在培養(yǎng)基中添加游離膽固醇，融合率可由原來的44.76％左右穩(wěn)定提高到93.25％左右，建立起穩(wěn)定的大鼠雜交瘤融合方法;(2)未融合B細胞的凋亡時間是影響融合檢測特異性的影響因素，通過兩次換液延長融合檢測間隔時間，顯著

4、降低了融合檢測本底，建立了優(yōu)化的融合檢測方法;(3)大鼠骨髓瘤細胞的成集落特性是影響雜交瘤單克隆化的關鍵影響因素，通過比較多種克隆化方法，最終確定改良的有限稀釋法作為最佳的大鼠雜交瘤克隆化方法，提高了獲得大鼠單克隆雜交瘤的成功率。(4)大鼠雜交瘤細胞在LOU/CN大鼠腹腔內(nèi)的腹水誘導成功率與大鼠融合伴侶細胞YB2/0是否適應LOU/CN大鼠腹腔有關，通過將YB2/0細胞導入LOU/CN大鼠腹腔反復馴化，顯著提高了YB2/0細胞在LOU/

5、CN大鼠腹腔內(nèi)的適應性，使大鼠雜交瘤細胞的單抗腹水誘導成功率從原來的49.25％提高到93.25％。
　　 其次，利用優(yōu)化后的大鼠-大鼠雜交瘤技術制備出53個抗HIV病毒衣殼蛋白大鼠單抗(anti-P24rat-mAb)，通過單抗的配對篩選，發(fā)現(xiàn)兩株大鼠單抗13F8和15A2作為捕獲單抗能夠與商品化試劑盒中的標記單抗形成最佳配對，不僅靈敏度高且降低了假陽性血清的反應性。上述單抗為進一步改良第四代HIV診斷試劑盒提供了重要的候選原