豬帶絳蟲Ddi1--like基因功能與其小分子抑制劑藥物可用性研究.pdf

1、寄生蠕蟲嚴(yán)重影響人類健康和養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，且與HIV等引起的免疫抑制疾病存在廣泛的共感染?，F(xiàn)今蠕蟲病或HIV-蠕蟲共感染的治療手段有限，且存在嚴(yán)重的藥物互作和副作用。DNA損傷誘導(dǎo)蛋白1樣蛋白（DNA damage-inducible protein1 like protein，Ddi1-like），與HIV蛋白酶同屬于反轉(zhuǎn)錄型天冬氨酸蛋白酶。該類蛋白在真核生物上具有重要的作用，已證明作為HIV蛋白酶抑制劑(HIVPIs)的靶標(biāo)用于HIV

2、與原蟲共感染的治療。我們前期的研究證明絳蟲和吸蟲基因組中存在唯一的Ddi-like蛋白編碼基因。本研究以豬帶絳蟲Ddi-like(TsDdi1-like)為研究對象，進(jìn)行了基因克隆、真核表達(dá)及功能研究，驗證TsDdi1-like是否為HIVPIs的靶標(biāo)，并明確HIVPIs對絳蟲的抑制效果，探討HIVPIs作為治療絳蟲的新型藥物及單一藥物治療HIV與蠕蟲共感染的可能性?，F(xiàn)取得以下結(jié)果:
　　1.參考基因組注釋信息，設(shè)計5'和3'端特

3、異性引物，利用cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)獲得TsDdi1-like基因全長cDNA序列。對該序列進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明TsDdi1-like基因ORF序列大小為1173bp，可編碼390個氨基酸，包含反轉(zhuǎn)錄天冬氨酸蛋白結(jié)構(gòu)域(RVP)和泛素化樣結(jié)構(gòu)域(UBA)。
　　2.構(gòu)建了畢赤酵母真核表達(dá)重組質(zhì)粒pPIC9K-TsDdi1-like，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)，獲得重組蛋白TsDdi1-like，其分子量大小為55kD。酶動力

4、學(xué)實驗證明，TsDdi1-like在此條件下不具有水解活性，不能降解熒光底物RE-(EDANS)-SQNYPIVQK-(DABCYL)-R和Bz-RGFFL-4MβNA，與大多數(shù)Ddi1同源蛋白一致。
　　3.利用TsDdi1-like蛋白特異性合成肽序列和真核表達(dá)獲得的純化重組蛋白分別免疫家兔，4次免疫后獲得兩種效價均達(dá)到1∶12800的多克隆抗體。經(jīng)Wsetern-blotting檢測兩種抗體均具有很高的特異性，證明了該蛋白抗

5、體不與其他蛋白發(fā)生免疫交叉反應(yīng)。免疫組化結(jié)果表明，兩種抗體具有相同的定位結(jié)果，TsDdi1-like在豬帶絳蟲的頭節(jié)各個部位均有表達(dá)，成彌散性分布，TsDdi1-like可能具有重要的基礎(chǔ)生理作用，與組成型的轉(zhuǎn)錄情況相符。
　　4.利用釀酒酵母Ddi1基因缺失株16141進(jìn)行基因回補(bǔ)試驗，證明TsDdi1-like可以影響釀酒酵母4742株蛋白分泌，小分子抑制劑試驗證明， HIVPIs可有效抑制TsDdi1-like蛋白活性，Ts