番茄紅素對(duì)2型糖尿病大鼠氧化和非酶糖化的影響.pdf

1、本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)高脂飼料喂養(yǎng)SD大鼠4周并在此基礎(chǔ)上給予小劑量鏈尿佐菌素(STZ)，建立2型糖尿病大鼠模型，然后采用不同劑量的番茄紅素進(jìn)行干預(yù)，以探討番茄紅素對(duì)2型糖尿病大鼠氧化和非酶糖化水平的影響。該研究通過(guò)充分利用番茄紅素的生理功能，開(kāi)發(fā)新的藥物和功能性食品，為糖尿病的治療提供一條新出路。 研究目的： 1.建立2型糖尿病大鼠模型。 2.觀(guān)察番茄紅素對(duì)2型糖尿病大鼠血糖和胰島素水平的影響。 3.觀(guān)察番茄紅素

2、對(duì)2型糖尿病大鼠氧化水平的影響。 4.觀(guān)察番茄紅素對(duì)2型糖尿病大鼠非酶糖化水平的影響。 研究方法： 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立和干預(yù)將體重在180-220g左右的70只SPF級(jí)雄性SD大鼠喂飼普通飼料適應(yīng)一周后，按體重隨機(jī)分成2組：正常對(duì)照組10只，喂飼普通飼料；高脂組60只，喂飼高脂飼料。高脂飼料喂養(yǎng)4周后測(cè)定大鼠血糖和血清胰島素水平，用計(jì)算得到的內(nèi)穩(wěn)態(tài)模型評(píng)價(jià)指數(shù)來(lái)鑒定大鼠胰島素抵抗是否誘導(dǎo)成功。將胰島素抵抗誘導(dǎo)成

3、功的大鼠隨機(jī)分為兩組，高脂對(duì)照組和造模組，給予造模組大鼠腹腔注射STZ，一周后測(cè)定大鼠血糖水平和口服葡萄糖耐量試驗(yàn)。根據(jù)2型糖尿病大鼠的診斷標(biāo)準(zhǔn)空腹血糖≥7.0mmol/L，2h血糖≥11.0mmol/L，將造模成功大鼠按血糖值隨機(jī)分為4組：糖尿病模型組、番茄紅素高劑量組20mg/kg．bw/d、中劑量組10mg/kg．bw/d、低劑量組5mg/kg．bw/d。加上高脂對(duì)照組共5組實(shí)驗(yàn)對(duì)象，各組大鼠繼續(xù)給予高脂飼料喂養(yǎng)。干預(yù)組大鼠每天采

4、用番茄紅素油溶液灌胃，DM組和高脂對(duì)照組采用空白油溶液灌胃。干預(yù)期間，每?jī)芍軠y(cè)一次血糖，每周測(cè)一次體重，記錄進(jìn)食量，觀(guān)察尿量、飲水量。正常對(duì)照組大鼠在干預(yù)開(kāi)始前處死。干預(yù)10周后，所有大鼠做如下處理： 1.1經(jīng)大鼠股動(dòng)脈采血，采集新鮮全血和抗凝全血，抗凝全血靜置離心分離血清，-40℃保存。1.2分離大鼠的心、肝、脾、腎、胰腺并稱(chēng)重用于臟器系數(shù)評(píng)價(jià)，并將肝臟和胰腺凍存于-80℃。 2.檢測(cè)指標(biāo)及方法： 2.1口服葡萄糖耐量

5、試驗(yàn)按照3g/kg．bw劑量標(biāo)準(zhǔn)用50％葡萄糖溶液給大鼠灌胃，分別在灌胃后0、30、60和120min后斷尾取血，采用血糖儀直接測(cè)定葡萄糖濃度變化情況，計(jì)算出血糖曲線(xiàn)下面積。 2.2胰島素抵抗指數(shù)用內(nèi)穩(wěn)態(tài)模型評(píng)價(jià)指數(shù)表示，HOMA-R=血糖濃度(mmol/L)×血清胰島素濃度(μIU/mL)/22.5，1μIU/mL=6.945pmol/L。 2.3肝臟組織中番茄紅素含量：高效液相色譜法。 2.4血脂水平測(cè)定：采

6、用酶法測(cè)定血清總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)的含量；低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平采用直接法測(cè)定。 2.5血糖水平測(cè)定：采用葡萄糖氧化酶法。 2.6血清氧化型低密度脂蛋白(ox．LDL)和胰島素水平測(cè)定：采用EIASA法。 2.7氧化水平測(cè)定：總抗氧化能力測(cè)定(T-AOC)采用菲羅啉比色法；丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法；超氧化物歧化酶(SOD)采用黃

7、嘌呤氧化酶法；過(guò)氧化氫酶(CAT)采用鉬酸比色法；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSI-Px)采用2-硝基苯甲酸(DTNB)直接法。胰腺組織中蛋白含量測(cè)定：采用考馬斯亮蘭法。 2.8全血中糖化血紅蛋白(GHb)水平測(cè)定：采用TBA比色法。 2.9血清糖化低密度脂蛋白(Gly-LDL)水平測(cè)定：采用氯化硝基四氮唑藍(lán)還原法。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.2型糖尿病大鼠模型建立高脂飼料喂養(yǎng)4周后，高脂組大鼠體重、血清總膽固醇、甘油三

8、酯、低密度脂蛋白膽固醇、胰島素水平和HOMA-R均高于正常對(duì)照組(P<0.05)。進(jìn)食量、空腹血糖水平(FBG)和高密度脂蛋白膽固醇水平與正常對(duì)照組比較，無(wú)顯著性差異(P>0.05)。因此，可以認(rèn)為高脂組大鼠胰島素抵抗誘導(dǎo)成功。 將胰島素抵抗誘導(dǎo)成功的大鼠隨機(jī)分為兩組，高脂對(duì)照組lO只和2型糖尿病造模組50只。注射STZ后的一周內(nèi)，造模組大鼠共有3只死亡。根據(jù)造模組大鼠OGTT和FBG結(jié)果，共有5只不符合2型糖尿病大鼠的診斷標(biāo)準(zhǔn)

9、，最后共有42只2型糖尿病大鼠和10只高脂對(duì)照組大鼠進(jìn)入實(shí)驗(yàn)干預(yù)階段。 造模成功的大鼠空腹血糖值明顯高于正常對(duì)照組和高脂對(duì)照組，血清胰島素水平和正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P>0.05)，而低于高脂對(duì)照組(P<0.05)。DM組大鼠HOMA-R高于正常對(duì)照組和高脂對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。因此，可以認(rèn)為2型糖尿病大鼠模型建立成功。 2.2型糖尿病大鼠模型穩(wěn)定性的判斷干預(yù)期間DM組大鼠血糖始終穩(wěn)定在較高的水平，

10、番茄紅素干預(yù)組大鼠血糖水平有所降低，但是始終高于高脂對(duì)照組(P<0.05)。DM組和各干預(yù)組大鼠體重增長(zhǎng)緩慢，高脂對(duì)照組大鼠體重一直處于快速生長(zhǎng)狀態(tài)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在干預(yù)期間，2型糖尿病大鼠逐漸出現(xiàn)毛色暗淡，動(dòng)作遲緩，精神萎靡等癥狀，干預(yù)組和DM組大鼠飲水量和尿量均明顯增多。故該2型糖尿病模型較為穩(wěn)定。 3.番茄紅素干預(yù)期間大鼠一般情況 3.1不同實(shí)驗(yàn)組大鼠的進(jìn)食量干預(yù)期間，將HF組、DM組和高、中、

11、低三個(gè)干預(yù)組大鼠的進(jìn)食量進(jìn)行比較，結(jié)果顯示5組大鼠的日平均進(jìn)食量沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 3.2各組大鼠臟器的比值干預(yù)結(jié)束后，對(duì)各實(shí)驗(yàn)組大鼠的心臟、肝臟、脾臟、胰腺指數(shù)進(jìn)行比較，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。DM組和高、中、低干預(yù)組2型糖尿病大鼠腎臟指數(shù)高于高脂對(duì)照組(P<0.05)。 3.3大鼠肝臟中番茄紅素的水平高脂對(duì)照組和DM組大鼠肝臟的番茄紅素水平在檢測(cè)線(xiàn)以下，而不同劑量干預(yù)組大鼠肝臟番茄紅素的水平

12、不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，高劑量組>中劑量組>低劑量組。 4.番茄紅素對(duì)2型糖尿病大鼠血糖和胰島素水平的影響干預(yù)結(jié)束時(shí)，與DM組大鼠比較，番茄紅素干預(yù)組大鼠血糖濃度均降低，而且中、高劑量組比低劑量組大鼠血糖濃度下降更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各干預(yù)組大鼠血清胰島素水平高于DM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，各干預(yù)組間血清胰島素水平無(wú)明顯差異。與DM組比較，低劑量組2型糖尿病大鼠HOMA-R無(wú)變化

13、，中劑量和高劑量組大鼠HOMA-R下降(P<0.05)，說(shuō)明2型糖尿病大鼠體內(nèi)胰島素抵抗?fàn)顩r有所改善。 5.番茄紅素對(duì)2型糖尿病大鼠氧化水平的影響 5.1番茄紅素對(duì)大鼠血液中T-AOC、MDA、CAT、總SOD和GSH-Px的影響DM組大鼠體內(nèi)明顯處于氧化應(yīng)激水平，血液中總抗氧化能力下降，抗氧化酶CAT、總SOD和GSH-Px活性也低于高脂對(duì)照組，而MDA水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。干預(yù)組與DM組比較

14、，總抗氧化能力、CAT、總SOD和GSH-Px活性均升高，同時(shí)MDA水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 5.2番茄紅素對(duì)大鼠胰腺中T-AOC、MDA、CAT、總SOD和GSH-Px的影響DM組大鼠胰腺組織中總抗氧化能力下降，抗氧化酶CAT、總SOD和GSH-Px活性明顯降低，MDA水平明顯高于高脂對(duì)照組(P<0.05)。與DM組比較，干預(yù)組胰腺組織總抗氧化能力、CAT、總SOD和GSIt-Px活性顯著升高，MDA水平下

15、降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 6.番茄紅素對(duì)2型糖尿病大鼠氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的影響與高脂對(duì)照組比較，DM組大鼠體內(nèi)ox-LDL水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與DM組比較，高、中、低三個(gè)劑量組ox-LDL水平均降低(P<0.05)，其中高劑量組的ox-LDL水平下降最明顯。 7.番茄紅素對(duì)2型糖尿病大鼠非酶糖化的影響與高脂對(duì)照組比較，DM組大鼠體內(nèi)GHb和Gly-LDL水平較高，

16、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與DM組比較，三個(gè)劑量組GHb水平均有下降，其中高劑量組下降最明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同劑量組番茄紅素對(duì)Gly-LDL水平影響不明顯，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 8.相關(guān)分析 8.1 2型糖尿病大鼠血糖濃度與GHb水平的關(guān)系2型糖尿病大鼠血糖濃度為自變量，GHb水平為因變量，計(jì)算自變量與因變量之間直線(xiàn)相關(guān)系數(shù)r=0.45，相關(guān)系數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

17、因此，可以認(rèn)為2型糖尿病大鼠體內(nèi)GHb水平隨著血糖濃度的升高而升高。 8.2 2型糖尿病大鼠GHb和ox-LDL與脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物MDA的關(guān)系2型糖尿病大鼠體內(nèi)GHb和ox-LDL為自變量，血清MDA水平為因變量，計(jì)算各自變量與因變量之間直線(xiàn)相關(guān)系數(shù)r分別為0.72和0.71。結(jié)果表明血清中MDA的含量與GHb和ox-LDL水平呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論： 1.高脂飼料喂養(yǎng)4周加小劑量