黃芩及同屬混淆品種子的系統(tǒng)鑒別研究.pdf

1、黃芩為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根，此外，在實(shí)際應(yīng)用中還存在一些地方代用品與混淆品，河北省為黃芩主產(chǎn)區(qū)，同時(shí)大量分布有粘毛黃芩ScutellariaviscidulaBge.，并頭黃芩ScutellariascordifoliaFischexSchrank，沙灘黃芩ScutellariastrigillosaHemsl，北京黃芩ScutellariapekinensisMaxim等多種同

2、屬植物。近年來(lái)，主產(chǎn)地栽培黃芩逐步成為主要商品來(lái)源，但是，種子市場(chǎng)基源品種混亂，僅憑感官識(shí)別，同名異物、同物異名現(xiàn)象嚴(yán)重。幾種黃芩屬植物的種子在外部形態(tài)上非常相近，難以宏觀鑒別，為確保黃芩藥材質(zhì)量的穩(wěn)定可控，在規(guī)?；?、規(guī)范化種植中首先要保證黃芩種源純化、優(yōu)良。本實(shí)驗(yàn)從外觀性狀、顯微特征、理化性質(zhì)等方面，并利用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)技術(shù)及超微技術(shù)對(duì)黃芩屬幾種植物的種子進(jìn)行綜合鑒別研究。既有快速、簡(jiǎn)便、實(shí)用、滿足基層需要的方法又有新技術(shù)與傳

3、統(tǒng)中藥鑒定技術(shù)交叉融合的深層次鑒別研究，也是我省制定中藥種子標(biāo)準(zhǔn)前重要的應(yīng)用基礎(chǔ)研究。 一、性狀、顯微、理化鑒別 目的：應(yīng)用快速、簡(jiǎn)便、實(shí)用的方法，建立黃芩、粘毛黃芩、沙灘黃芩、并頭黃芩、北京黃芩種子的外觀性狀、顯微特征、超微特征、理化性質(zhì)方面的綜合鑒別信息指征。 方法：1.外觀性狀觀察。2.脫色表面片制備：(1)脫色：取種皮切成l-2mm小塊浸入水合氯醛溶液中。(2)壓片觀察。3.石蠟橫切片制備：(1)取材和

4、固定：種子用蒸餾水4℃浸泡一周以上，F(xiàn).A.A固定液固定一周以上。(2)脫水：依次用濃度為70％、80％、90％、95％的乙醇溶液、無(wú)水乙醇進(jìn)行脫水，每隔2-3h調(diào)換溶液。(3)透明：二甲苯一無(wú)水乙醇(1：1)浸種1h后，轉(zhuǎn)入二甲苯中至種子透明為止。(4)浸蠟：65℃恒溫箱中進(jìn)行，半小時(shí)調(diào)蠟一次，至種子完全浸透。(5)包埋和切片：石蠟包埋，切片厚度12μm。(6)貼片和融蠟。(7)染色：番紅一固綠雙重染色。(8)脫水與封藏。4.種皮掃描

5、電鏡觀察(1)清洗：取種子用50％乙醇超聲清洗5min。(2)脫水：50％、60％、70％、80％、90％、100％乙醇逐級(jí)脫水，每一級(jí)脫水兩次，每次30min，其間不斷震蕩清洗。(3)固定：戊二醛固定30min。(4)電鏡觀察：真空噴金后，進(jìn)行觀察。5.紫外掃描圖譜特征：(1)取一定量黃芩、粘毛黃芩、沙灘黃芩和并頭黃芩種子粉末用石油醚索氏提取3h，制備供試液A；揮干石油醚用乙酸乙酯索氏提取3h，制備供試液B；然后揮干乙酸乙酯用甲醇索氏

6、提取3h，制備供試液C。(2)掃描波長(zhǎng)為200-400nm的紫外吸收?qǐng)D譜。(3)圖譜分析。7.薄層色譜鑒別：(1)取一定量黃芩、粘毛黃芩、沙灘黃芩和并頭黃芩種子粉末用石油醚索氏提取3h制備供試液D，供點(diǎn)樣；另取種子粉末適量用70％乙醇超聲提取制備供試液E。(2)點(diǎn)樣，展開。(3)顯色、觀察、照相。 結(jié)果：1.宏觀性狀：五種種子均為近球形，黃芩和粘毛黃芩種子稍大，顏色為棕黑色，其余三種黃芩種子稍小，顏色稍淺，整體性狀相似不易區(qū)分。

7、2.脫色表面片：幾種種子在內(nèi)外表面細(xì)胞形狀、細(xì)胞壁增厚和內(nèi)含物方面有一定的區(qū)別。3.石蠟橫切片：幾種種子在表面凸起，果皮細(xì)胞層數(shù)、形狀和表面角質(zhì)層次級(jí)凸起特征上都有明顯差別。4.掃描電鏡觀察：幾種種子的次級(jí)凸起的微觀特征明顯差別。5.紫外掃描圖譜：乙酸乙酯和甲醇提取部分的吸收峰數(shù)目和吸收峰位置有一定差別。7.薄層色譜：幾種供試液黃芩、粘毛黃芩、沙灘黃芩和并頭黃芩種子的薄層色譜有一定差別，可用于鑒別。 結(jié)論：黃芩及其同屬植物的種子

8、在外觀性狀、顯微特征、理化性質(zhì)存在差異，由此可以用于鑒別。方法快速、簡(jiǎn)便、實(shí)用，適用于幾種種子的快速鑒別。 二、細(xì)胞生物學(xué)及分子生物學(xué)特征研究 目的：利用染色體組型分析、種子蛋白質(zhì)PAGE技術(shù)及RAPD技術(shù)研究藥用黃芩品種之間及黃芩屬幾種植物的綜合鑒別信息指征，從細(xì)胞水平及分子水平鑒別真?zhèn)?，并為黃芩的品種篩選提供依據(jù)。 方法：1.根尖體細(xì)胞染色體標(biāo)本片制備：(1)預(yù)處理：種子25℃下萌發(fā)，根尖長(zhǎng)1-2cm時(shí)切取，

9、蒸餾水0-3℃處理24h。(2)固定：卡諾固定液(無(wú)水乙醇∶冰醋酸3∶1)固定。(3)解離：95％乙醇∶濃鹽酸(1∶1)解離5-10min。(4)后低滲：重蒸水低滲，時(shí)間8-15min。(5)染色：改良石炭酸品紅液染色。(6)封片：冰凍揭蓋片，中性樹膠封片。(7)顯微照相、計(jì)數(shù)、測(cè)量。2.聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)圖譜特征研究：(1)制備供試品溶液。(2)制備分離膠和濃縮膠。(3)電泳：恒定電壓120-180V。(4)染色和洗脫：考

10、馬斯亮藍(lán)(R-250)染色，脫色液洗脫至背景清晰為止。(5)結(jié)果分析：繪圖并測(cè)定特征譜帶泳動(dòng)率。3.RAPD技術(shù)鑒別：(1)高鹽低pH法提取純化植物總DNA。 (2)PCR擴(kuò)增及引物篩選。(3)圖譜分析。 結(jié)果： 1.根尖體細(xì)胞染色體組型特征：黃芩染色體2n=18，染色體總長(zhǎng)度48.9μm，平均長(zhǎng)度2.7μm，變異倍數(shù)為2.05；粘毛黃芩染色體總數(shù)為2n=18，染色體總長(zhǎng)度53μm，平均長(zhǎng)度2.95μm，變異倍數(shù)

11、為2.44。 2.聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)圖譜特征：黃芩、粘毛黃芩和沙灘黃芩種子的譜帶數(shù)目和位置不同。黃芩圖譜中一級(jí)帶6條，二級(jí)帶1條；粘毛黃芩圖譜中一級(jí)帶1條，二級(jí)帶4條，三級(jí)帶2條；沙灘黃芩圖譜中一級(jí)帶1條，二級(jí)帶2條，三級(jí)帶4條。幾種黃芩之間有明顯差別。 3.RAPD鑒別研究：篩選出可對(duì)黃芩、粘毛黃芩、沙灘黃芩進(jìn)行有效擴(kuò)增的引物11條，在擴(kuò)增條帶數(shù)目和位置上有明顯差異，可用于鑒別。 結(jié)論：應(yīng)用分子生物