S-生物丙烯菊酯對(duì)人淋巴細(xì)胞的毒性作用及基因表達(dá)譜變化的初步研究.pdf

1、隨著社會(huì)和科技的發(fā)展，環(huán)境安全問(wèn)題逐漸被提上議事日程。農(nóng)藥使用的日漸廣泛，使得作為蚊香、蚊片、殺蟲(chóng)劑等主要有效成分的S-生物丙烯菊酯(S-bioallethrin)和人們的生產(chǎn)生活接觸日益密切，其遠(yuǎn)后效應(yīng)也逐漸顯露出來(lái)。人們發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期接觸S-生物丙烯菊酯會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)和過(guò)敏樣的綜合征，并伴有肌肉和關(guān)節(jié)的疼痛綜合征，如記憶力減退、嗅覺(jué)減退、脫發(fā)、甲狀腺功能減退、白癜風(fēng)、過(guò)敏反應(yīng)等；許多研究都表明S-生物丙烯菊酯具有一定的免疫毒性和神經(jīng)毒性

2、。 S-生物丙烯菊酯對(duì)免疫系統(tǒng)具有的毒性作用表現(xiàn)為：可以抑制T淋巴細(xì)胞增殖，導(dǎo)致嗜堿粒細(xì)胞釋放組胺；可有效的抑制IL-4和IFN-γ的產(chǎn)生；還可抑制細(xì)胞內(nèi)Th2特異性的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)催化因子6(STAT6)，從而抑制淋巴細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；過(guò)敏體質(zhì)的人比正常人更易對(duì)S-生物丙烯菊酯產(chǎn)生中毒癥狀。S-生物丙烯菊酯對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有的毒性作用表現(xiàn)為：可導(dǎo)致幼年小鼠腦皮質(zhì)乙酰膽堿受體減少，并導(dǎo)致腦皮質(zhì)永久性病理改變和成年后行為異常；可抑制白細(xì)胞膜和神

3、經(jīng)突觸體的ATP酶活性，從而確定了S-生物丙烯菊酯對(duì)哺乳動(dòng)物的神經(jīng)毒性是因?yàn)閷?dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞膜功能的整體失調(diào)。但S-生物丙烯菊酯對(duì)機(jī)體毒性作用的具體機(jī)制尚未闡明。 S-生物丙烯菊酯的毒性作用必然會(huì)對(duì)機(jī)體的基因表達(dá)造成一定影響，但如何影響仍尚未闡明，因此，本課題擬研究S-生物丙烯菊酯處理后正常人淋巴細(xì)胞的基因表達(dá)變化。尋找差異基因的方法有很多種，如差異顯示技術(shù)、代表性差異分析、抑制性消減雜交、基因芯片等。其中基因芯片是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的

4、一門新的基因分析技術(shù)，尤其是表達(dá)譜基因芯片，可對(duì)基因表達(dá)情況進(jìn)行全面、快速、敏感、高效的分析，因此本課題選用表達(dá)譜基因芯片作為研究工具。 本課題首先從形態(tài)學(xué)方面觀察了S-生物丙烯菊酯處理后正常人淋巴細(xì)胞的變化，然后進(jìn)一步分析了淋巴細(xì)胞基因表達(dá)的改變，從而初步闡明了S-生物丙烯菊酯對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)和基因組的毒性作用。 論文分兩部分： 第一部分：采用光鏡、流式細(xì)胞儀、透射電鏡、DNA片斷化檢測(cè)等方法，觀測(cè)了S-生物丙烯

5、菊酯處理后正常人淋巴細(xì)胞的各種變化。首先從正常人外周血中分離淋巴細(xì)胞，對(duì)照組為正常淋巴細(xì)胞；植物血球凝集素(PHA)組在正常淋巴細(xì)胞中加入PHA，終濃度為20mg/L；S-生物丙烯菊酯組在正常淋巴細(xì)胞中加入PHA和S-生物丙烯菊酯，終濃度分別為20mg/L和4.5mg/L，進(jìn)行光鏡檢測(cè)。對(duì)三組細(xì)胞分別進(jìn)行固定、漂洗、碘化丙啶(PI)染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。然后對(duì)正常和S-生物丙烯菊酯組細(xì)胞進(jìn)行固定、脫水、滲透、包埋、聚合、切片、染色、透射

6、電鏡觀察。最后提取兩組細(xì)胞的基因組DNA，1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。 結(jié)果：在光鏡下觀察S-生物丙烯菊酯處理后的正常人淋巴細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖被部分抑制，有的細(xì)胞體積變小、變形，細(xì)胞核濃縮，但細(xì)胞膜完整。采用單向方差分析(OneWayANOVA)結(jié)果表明S-生物丙烯菊酯可以抑制細(xì)胞增殖(P＜0.001)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示S-生物丙烯菊酯處理組淋巴細(xì)胞S期和G2期均比PHA處理組降低，但仍高于正常淋巴細(xì)胞組，表明淋巴細(xì)胞增殖

7、被部分抑制；且G1期峰前出現(xiàn)亞二倍體峰，表明可能有凋亡細(xì)胞群體，百分率為32％。透射電鏡結(jié)果顯示S-生物丙烯菊酯處理組淋巴細(xì)胞核染色質(zhì)高度凝集、邊緣化，細(xì)胞呈現(xiàn)出凋亡特征。DNA片斷化檢測(cè)結(jié)果顯示S-生物丙烯菊酯處理組細(xì)胞DNA電泳條帶呈典型的梯狀條帶，可見(jiàn)每隔200bp位置出現(xiàn)DNA降解條帶，表明細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。 結(jié)論：S-生物丙烯菊酯可以有效地抑制正常淋巴細(xì)胞增殖，使細(xì)胞增殖進(jìn)程受阻，并可導(dǎo)致部分淋巴細(xì)胞凋亡，對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)具

8、有一定的毒性。 第二部分：運(yùn)用基因芯片技術(shù)，檢測(cè)了S-生物丙烯菊酯處理后淋巴細(xì)胞的基因表達(dá)譜變化。首先提取正常和S-生物丙烯菊酯組淋巴細(xì)胞的總RNA，采用AgilentBioAnalyzer2100進(jìn)行RNA樣品的質(zhì)量鑒定。采用Agilent低RNA熒光線性擴(kuò)增試劑盒對(duì)樣品進(jìn)行雙色熒光標(biāo)記：總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以Cy3標(biāo)記正常淋巴細(xì)胞，Cy5標(biāo)記S-生物丙烯菊酯處理組淋巴細(xì)胞，合成熒光標(biāo)記的cRNA，并對(duì)標(biāo)記的cRNA進(jìn)

9、行純化。純化后的樣品和AgilentHuman1A60mer寡核苷酸基因芯片進(jìn)行雜交，雜交完畢后依次用漂洗緩沖液進(jìn)行芯片的漂洗。然后采用Agilent基因芯片掃描儀掃描，掃描后的數(shù)據(jù)采用FeatureExtraction軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集及標(biāo)準(zhǔn)化處理。然后采用Panther數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行生物學(xué)功能分析。最后采用半定量RT-PCR對(duì)有進(jìn)一步研究?jī)r(jià)值且表達(dá)改變顯著的基因FXR2、TNFRSF10A、AIRE和IL-19進(jìn)行驗(yàn)證。

10、 結(jié)果：在芯片22153個(gè)檢測(cè)點(diǎn)中，發(fā)現(xiàn)共同差異表達(dá)基因346個(gè)，其中23個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，主要涉及凋亡(CEBPB、TNFRSF10A、BLK、CARD9、FXR2、DLGAP1、ATF1)，發(fā)育過(guò)程(PAFAH1B3、GLI2、FLJ90440)，核苷酸代謝(SFRS12)等方面；323個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，主要涉及免疫與防御[MR-1、IRF2、A1(SAA1)、AIF1、CXCL1、IL-19、KREMEN2、HSPCA、ANXA8

11、、HSF2、AIRE]，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)(OTX2、RARG、ERG、PTTG1、ZNF135、KLF12)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(SDK2、CNGB1、PIK3R2、PTCH、ELK3、KIAA1854)，細(xì)胞增殖和分化(ESM1、REA、ING3)等方面。RT-PCR結(jié)果表明，S-生物丙烯菊酯處理后，AIRE和IL-19的表達(dá)下調(diào)，F(xiàn)XR2和TNFRSF10A的表達(dá)上調(diào)，與芯片雜交結(jié)果基本一致。 結(jié)論：S-生物丙烯菊酯處理后淋巴細(xì)胞基因表達(dá)譜的

12、變化為：促凋亡基因表達(dá)上調(diào)的同時(shí)凋亡抑制基因表達(dá)下調(diào)，促增殖基因表達(dá)下調(diào)，并有多個(gè)促進(jìn)細(xì)胞增殖信號(hào)傳導(dǎo)、促進(jìn)免疫應(yīng)答的基因表達(dá)下調(diào)?；虮磉_(dá)的總體變化趨勢(shì)是促進(jìn)凋亡、抑制增殖，表明S-生物丙烯菊酯對(duì)基因組具有一定的毒性。 綜上所述，本研究采用S-生物丙烯菊酯處理正常人淋巴細(xì)胞，利用光鏡、流式細(xì)胞儀、透射電鏡、DNA片斷化檢測(cè)等手段，觀測(cè)了淋巴細(xì)胞的變化。研究表明，S-生物丙烯菊酯可以抑制淋巴細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)部分淋巴細(xì)胞凋亡，具有