天然植物精油防治養(yǎng)殖大菱鲆細(xì)菌性疾病的作用及機(jī)制研究.pdf

1、大菱鲆（Scophthalmus maximus）俗稱“多寶魚”，自從1992年由英國(guó)引入我國(guó)后，大菱鲆的養(yǎng)殖規(guī)模和產(chǎn)量逐年擴(kuò)大，目前已成為我國(guó)北方海水養(yǎng)殖魚類產(chǎn)量最大的品種。但隨著高密度工廠化養(yǎng)殖的迅速發(fā)展，細(xì)菌性病害問題日趨嚴(yán)重，嚴(yán)重制約了大菱鲆養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。目前大菱鲆細(xì)菌性病害的控制手段主要依賴于抗生素和消毒劑等化學(xué)藥物，但由此會(huì)帶來細(xì)菌耐藥性、養(yǎng)殖水體污染及海產(chǎn)品中藥物殘留問題。因此，隨著人們對(duì)海產(chǎn)品質(zhì)量安全要求的日益

2、提高，迫切需要尋求一種高效安全、環(huán)境友好的抗菌制劑替代抗生素和消毒劑等化學(xué)藥物，并用于控制大菱鲆及其養(yǎng)殖環(huán)境中的致病菌，以實(shí)現(xiàn)從源頭上解決養(yǎng)殖大菱鲆中藥物殘留問題。
　　植物精油（Essential oils）亦稱作植物揮發(fā)油，是從芳香植物中提取的具有揮發(fā)性的脂溶性天然化合物，具有多種生物學(xué)活性，如抗菌、驅(qū)殺寄生蟲及免疫調(diào)節(jié)等。鑒于植物精油具有高效抗菌活性，近年來被視為潛在的抗生素替代品并用于防治水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌性疾病。本論文首先確定

3、大連地區(qū)養(yǎng)殖大菱鲆的關(guān)鍵致病菌，在此基礎(chǔ)上，首次嘗試將植物精油作為抗生素替代品應(yīng)用于養(yǎng)殖大菱鲆細(xì)菌性疾病的防治，具體研究?jī)?nèi)容如下：
　?。?）大連地區(qū)養(yǎng)殖大菱鲆細(xì)菌性病原的分離鑒定及抗生素藥敏實(shí)驗(yàn)。論文完成了對(duì)大連地區(qū)養(yǎng)殖大菱鲆主要細(xì)菌性疾病的流行性病原調(diào)查和研究，實(shí)驗(yàn)從大菱鲆養(yǎng)殖場(chǎng)采集患腹水、紅體、突眼和紅嘴4種典型臨床癥狀的病魚樣本，共分離純化出33株病原菌，通過透射電鏡觀察、16S rDNA測(cè)序、生理生化檢測(cè)最終鑒定歸為3種

4、常見水產(chǎn)致病菌，分別為遲鈍愛德華氏菌（Edwardsiella tarda，29株），大菱鲆弧菌（Vibrio scophthalmi，1株）和弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii，3株），通過人工攻毒回感試驗(yàn)證實(shí)遲緩愛德華氏菌、大菱鲆弧菌和弗氏檸檬酸桿菌是引起大連地區(qū)養(yǎng)殖大菱鲆細(xì)菌性疾病的關(guān)鍵病原菌；采用Kriby-Bauer紙片擴(kuò)散法完成了這3種致病菌（共選7株，E.tarda FS-S、HD-C及TY-X；V.

5、scophthalmi HZ-C1；C.freundii HZ-W、HZ-C2及HZ-F）對(duì)30種抗生素的藥敏實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示受測(cè)菌株均具有多重耐藥現(xiàn)象，且存在株間差異性。
　?。?）植物精油對(duì)養(yǎng)殖大菱鲆致病菌的體外抗菌活性及其機(jī)制。論文通過紙片擴(kuò)散法和微量肉湯稀釋法研究了檸檬醛、山蒼子精油、肉桂醛、百里香酚等16種天然植物精油對(duì)遲緩愛德華氏菌、大菱鲆弧菌及弗氏檸檬酸桿菌3種致病菌（共選7株，E.tarda FS-S、HD-C及TY

6、-X；V.scophthalmi HZ-C1；C.freundii HZ-W、HZ-C2及HZ-F）的抗菌活性，結(jié)果顯示肉桂醛、百里香酚和丁香酚對(duì)受測(cè)菌株具有較強(qiáng)抗菌活性，最小抑菌濃度均小于或等于1μL/mL；檸檬醛、檸檬草精油和山蒼子精油的抗菌活性次之，最小抑菌濃度范圍為0.25～4μL/mL，隨菌種和菌株不同而變化。此外，實(shí)驗(yàn)又通過細(xì)菌形態(tài)掃描和透射電鏡觀察、胞內(nèi)乳酸脫氫酶及核酸釋放研究山蒼子精油對(duì)不同致病菌株的膜損傷作用，以初步闡

7、明其抗菌機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)山蒼子精油可破壞致病菌株的細(xì)胞膜，并導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白酶和核酸外泄，致使細(xì)菌死亡。
　?。?）植物精油的體內(nèi)抗菌實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)選用山蒼子精油進(jìn)行體內(nèi)攻毒治療實(shí)驗(yàn)，分別對(duì)大菱鲆腹腔注射1×107CFU/尾E.tarta FS-S，2×107CFU/尾V.scophthalmi HZ-C1和1×107CFU/尾C.freundii HZ-C2，攻毒后經(jīng)0.2μL/mL山蒼子精油藥浴后，大菱鲆死亡率分別由60％（6/10）降

8、至20%（2/10），50%（5/10）降至0%（0/10），40%（4/10）降至20%（2/10），這為大菱鲆細(xì)菌性疾病的防治提供了另一種有效的抗生素替代品；以斑馬魚為模型，腹腔注射2×107CFU/尾E.tarta FS-S和1×106CFU/尾C.freundii HZ-C2，攻毒后經(jīng)0.2μL/mL山蒼子精油藥浴后，斑馬魚死亡率分別由90%（9/10）降至20%（2/10），60%（6/10）降至10%（1/10）。