SjHGPRT和SjSDISP全長cDNA的克隆、表達(dá)及保護(hù)性免疫研究.pdf

1、日本血吸蟲病是一種嚴(yán)重危害人類健康的人畜共患寄生蟲病。血吸蟲卵沉積于肝、腸等組織中形成蟲卵肉芽腫及其纖維化與疾病慢性化過程是日本血吸蟲病發(fā)病的主要基礎(chǔ)。由于病人病畜糞便中蟲卵對湖州的污染，陽性釘螺的存在，造成了血吸蟲病的反復(fù)再感染、導(dǎo)致血吸蟲病傳播與流行。因此，控制傳染源是湖區(qū)血吸蟲病重要的防治策略；阻斷傳播型抗卵疫苗包括抗血吸蟲卵胚發(fā)育和抗雌蟲生殖產(chǎn)卵的研究，一直是本課題組的重要攻關(guān)內(nèi)容。先前研究證明，未成熟卵可溶性抗原(SIEA)及

2、其SIEA26-28kDa組分具有明顯的抗血吸蟲卵胚發(fā)育和抗雌蟲生殖產(chǎn)卵效果。2000年在衛(wèi)生部專家組織的全國血吸蟲抗原疫苗免疫統(tǒng)一檢測試驗中，來源于本課題組研制的抗血吸蟲病天然分子疫苗(1號，主要成份為日本血吸蟲未成熟卵SIEA26-28kDa.組分)獲得最佳動物保護(hù)效果：53.9％減雌雄合抱率和89.3％肝減卵率(參見衛(wèi)生部安徽會議：專家大會報告P1-14，2000年7月)。近幾年來，本室借助蛋白質(zhì)組學(xué)等研究手段，對SIEA26-2

3、8kDa組分進(jìn)行了深入分析。通過雙向電泳和免疫印跡識別等技術(shù)手段，獲得了10多個相關(guān)抗原分子，其中以66、71和73號抗原分子免疫反應(yīng)最強，采用肽指紋圖譜分析發(fā)現(xiàn)它們分別與次黃嘌吟-鳥嘌吟磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)、琥珀酸脫氫酶鐵硫蛋白(SDISP)和谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)相關(guān)，但是否就是SIEA26-28kDa組分中起抗血吸蟲卵胚發(fā)育和抗雌蟲生殖產(chǎn)卵的主要成分，尚需進(jìn)一步鑒定。其中，GST作為血吸蟲疫苗候選分子研究報道很多，

4、除本研究組外，但尚未見到有關(guān)HGPRT和SDISP作為日本血吸蟲疫苗候選分子的報道。因此，進(jìn)一步深入研究SjHGPRT和SjSDISP作為日本血吸蟲疫苗候選分子的潛能顯得非常必要。 采用美國生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站對SjhGPRT和SjSDISP進(jìn)行搜索，發(fā)現(xiàn)二基因均有眾多的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)，但其3'端和5'端均不完整。本文擬用分子生物學(xué)等方面的技術(shù)和手段，克隆SjHGPRT和SjSDISP全長cDNA；構(gòu)建目的基因(ORF)

5、單價和二價原核重組表達(dá)質(zhì)粒，對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行免疫活性、免疫保護(hù)性研究，并對目的基因在成蟲中的定位和表達(dá)水平進(jìn)行檢測；構(gòu)建目的基因真核重組質(zhì)粒，通過真核重組質(zhì)粒免疫及其與原核重組蛋白的聯(lián)合免疫，評估其免疫保護(hù)性效果。 方法： 1)以日本血吸蟲成蟲cDNA文庫作模板，以文庫載體多克隆插入位點上下游鄰近核苷酸序列設(shè)計的上下游引物，以目的基因?qū)?yīng)的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)核苷酸序列設(shè)計的特異引物為引物，對目的基因不完整的5'端和3'

6、端進(jìn)行錨式PCR.擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物序列與對應(yīng)的EST進(jìn)行比對，基于重疊區(qū)，拼接獲得全長cDNA。 2)對所獲得全長cDNA進(jìn)行序列分析后，以成蟲cDNA文庫為模板擴(kuò)增目的基因全長編碼基因，構(gòu)建PQE30、pGEX-4T-1原核重組表達(dá)質(zhì)粒和pcDNA3真核重組質(zhì)粒。將原核重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌中，在大腸桿菌中進(jìn)行重組蛋白的表達(dá)、SDS-PAGE和Western-blot分析。用間接免疫熒光法對目的基因在蟲體中的定位和表達(dá)水平進(jìn)行檢

7、測。 3)用重組蛋白和真核重組質(zhì)粒免疫小鼠，評價二基因動物免疫保護(hù)性效果。動物實驗分以下幾組：對照組：佐劑(FCA)；空質(zhì)粒(pcDNA3)；日本血吸蟲rSjGST。實驗組：原核單價重組蛋白免疫組SjHGPRT/PQE30；SjSDISP/PQE30原核二價重組蛋白免疫組SjHGPRT/pGEX-4T-1：SjSDISP/pGEX-4T-1。真核重組質(zhì)粒免疫組SjHGPRT/pcDNA3；SjSDISP/pcDNA3。真、原核疫

8、苗聯(lián)合免以組(SjHGPRT/PQE30+SjHGPRT/pcDNA3)；(SjSDISP/PQE30+SjSDISP/pcDNA3)用減蟲率，每克肝、糞減卵率及每雌子宮內(nèi)卵減少率，對目的基因動物免疫保護(hù)性效果進(jìn)行評價。 結(jié)論： 1)采用錨式PCR首次獲得SjHGPRT和SjSDISP二基因全長cDNA，SjHGPRT全長cDNA 1270bp；SjSDISP全長cDNA 1071bp，且均在GenBank中成功注冊登錄

9、。 2)成功構(gòu)建了SjHGPRT和SjSDISP目的基因單價、二價原核重組表達(dá)質(zhì)粒和真核重組質(zhì)粒；原核重組表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌中獲得高效表達(dá)；純化的原核重組表達(dá)融合蛋白具有天然蛋白相同的抗原性；目的基因在成蟲體壁均有表達(dá)，但SjSDISP基因表達(dá)水平相對較低。 3)SjHGPRT和SjSDISP免疫小鼠均獲部分抗血吸蟲病免疫保護(hù)性效果；原核重組蛋白和真核重組質(zhì)粒聯(lián)合免疫能提高免疫保護(hù)性效果；減卵率普遍高于減蟲率，表明二基因