VEGF165質(zhì)粒轉(zhuǎn)染鼠EPCs的可行性及效應(yīng)研究.pdf

1、研究背景:
　　當(dāng)今社會在高血壓、糖尿病、高血脂、吸煙等動脈粥樣硬化高危因素的作用下，成人外周動脈疾病在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率約為3-10％，其中約有15-25％的PAD發(fā)生在＞70歲的患者中。而下肢動脈粥樣硬化閉塞癥(lower limbatherosclerosis obstruction，下肢ASO)這一種最常見的外周動脈疾病中，卻僅有約20％的患者有間歇性跛行、靜息痛等臨床表現(xiàn)，而80％的患者卻沒有明顯的臨床表現(xiàn)。由于患者往往

2、具有年齡高、下肢動脈血管病變解剖長度長、下肢動脈承受各種運(yùn)動所致機(jī)械應(yīng)力負(fù)擔(dān)重等各種客觀因素的影響，許多患者在進(jìn)行腔內(nèi)治療或手術(shù)治療后常反復(fù)發(fā)作。還有許多年長的下肢ASO患者治療因不能耐受外科手術(shù)治療以外而只能選擇保守治療，而且在嚴(yán)重下肢缺血患者中10％-30％患者于半年內(nèi)死亡，25％-35％的患者將面臨高位截肢。因此為了更好的解決下肢動脈粥樣硬化患者下肢血運(yùn)重建的這一難題，除了開發(fā)更有效的藥物以外，學(xué)界10多年來一直在研究有效的基因療

3、法。
　　2001年Shintani等通過對家兔單側(cè)后肢缺血模型進(jìn)行自體骨髓單個核細(xì)胞(Bone marrow derived mononuclear cells，BM-MNCs)移植研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞移植組較對照組側(cè)支血管形成及血管新生均有明顯改善，表明BM-MNCs移植有助于缺血肢體模型的血管化。此后國內(nèi)外相繼開展自體骨髓干細(xì)胞移植治療下肢缺血，并取得初步的療效。谷涌泉等發(fā)現(xiàn)自體骨髓干細(xì)胞移植治療下肢缺血性疾病的療效與移植的干細(xì)胞

4、總量密切相關(guān)，移植細(xì)胞量＜1105個/條下肢時(shí)無效或僅有微弱療效，移植細(xì)胞量＞1108個/條下肢時(shí)，大多數(shù)患者是有效的。經(jīng)過多年的研究，目前學(xué)界認(rèn)為存在于外周循環(huán)及骨髓干細(xì)胞群中的內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)在血管新生、修復(fù)和維持血管內(nèi)膜功能穩(wěn)定的過程中起到了極其重要的作用。但EPCs在成年動物外周血中數(shù)量極少，有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)EPCs的細(xì)胞數(shù)僅占外周血細(xì)胞的0.0001％，這意味著循環(huán)血中

5、的EPCs細(xì)胞數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于要達(dá)到有效緩解缺血癥狀所需的細(xì)胞數(shù)。并且，由于缺乏統(tǒng)一的分離方法與特異性的表面標(biāo)志物和生物學(xué)特性，EPCs也難以在體外進(jìn)行有效的分離和大規(guī)模擴(kuò)增。
　　除此之外目前學(xué)界主要認(rèn)為EPCs促進(jìn)新生血管形成的機(jī)制包括兩個方面:一方面是通過自身的分化增殖而形成新生血管，無需依賴原來的血管系統(tǒng);另一方面，EPCs本身可以分泌各種細(xì)胞生長因子，通過旁分泌及自分泌效應(yīng)促進(jìn)局部新生血管的形成，從而改善供血，而其中作用最強(qiáng)有

6、力的成血管因子是血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)。但是也有研究指出真正的EPCs是內(nèi)皮集落形成細(xì)胞(endothelial colony forming cells，ECFCs)，但是因?yàn)槟壳胺蛛x和培養(yǎng)的各種技術(shù)條件限制導(dǎo)致ECFCs中混雜有血細(xì)胞來源的促血管生成細(xì)胞(pro-angiogenic cells，PACs)。ECFCs的主要作用是通過自身的分化增殖形成新生

7、血管，而PACs的主要作用則是通過旁分泌及自分泌效應(yīng)來促進(jìn)局部新生血管的形成。然而對于EPCs具體的成血管功能以及其促新生血管形成功能的分子機(jī)制，學(xué)界仍知之甚少。
　　因此，進(jìn)一步研究EPCs生物學(xué)功能相關(guān)的分子機(jī)制將不但有利于提高人們對EPCs的分離、擴(kuò)增EPCs效率;而且有助于提高EPCs自身的成血管能力;對EPCs移植治療缺血性疾病的應(yīng)用具有重要意義。
　　研究目的:
　　1、明確VEGF165基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠骨

8、髓來源EPCs這一方法可行性，為提高EPCs的體外擴(kuò)增效率及成血管能力提供新方法。
　　2、進(jìn)一步闡明EPCs成血管能力與VEGF165及其下游信號分子PLCγ之間的關(guān)聯(lián)。
　　3、為指導(dǎo)臨床基因修飾干細(xì)胞移植治療下肢慢性缺血工作奠定一定基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　本實(shí)驗(yàn)首先通過用外源性VEGF165質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠骨髓來源內(nèi)皮祖細(xì)胞(BM-EPCs)來提高BM-EPCs對VEGF165的表達(dá)，并通過檢測轉(zhuǎn)染外源性V

9、EGF165質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染+PLCγ受體阻斷劑組與未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞在體外成血管能力的改變，及各組中VEGF受體下游的PLCγ通路上各個信號分子表達(dá)水平的改變，以進(jìn)一步從分子水平闡明EPCs的成血管能力與PLCγ信號通路之間的關(guān)聯(lián)機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.FITC-UEA-I染色陽性以及Dil-acLDL標(biāo)記陽性率約為50％，證實(shí)誘導(dǎo)分化的細(xì)胞為EPCs。
　　2.轉(zhuǎn)染96h后，僅有約8-10％左右的BM-EPCs表達(dá)Z