IL-1在腦皮質(zhì)發(fā)育不良形成中的作用研究.pdf

1、腦皮質(zhì)發(fā)育不良是兒童期難治性癲癇的最常見病因之一。其典型的病理學(xué)改變是皮質(zhì)板層結(jié)構(gòu)紊亂和異形、異位神經(jīng)元的出現(xiàn)。而導(dǎo)致這些病理改變的根本原因在于大腦皮質(zhì)板層結(jié)構(gòu)形成過程中出現(xiàn)了異常。神經(jīng)元遷移是大腦皮質(zhì)板層結(jié)構(gòu)形成的重要環(huán)節(jié)，因此神經(jīng)元的異常遷移是導(dǎo)致腦皮質(zhì)發(fā)育不良的一個重要原因。
　　目前關(guān)于腦皮質(zhì)發(fā)育不良發(fā)病機(jī)制的研究主要集中在遺傳因素，認(rèn)為特定基因（如Lis1、DCX）的變異是導(dǎo)致腦皮質(zhì)發(fā)育不良的主要原因。但并非所有的腦皮質(zhì)

2、發(fā)育不良患者都存在基因異常，且目前也缺乏公認(rèn)可靠的基因干預(yù)治療，因此對導(dǎo)致神經(jīng)元遷移異常的其它因素進(jìn)行研究，將可能為腦皮質(zhì)發(fā)育不良的防治提供新的策略。
　　我們課題組前期在炎癥與神經(jīng)元異常遷移領(lǐng)域做了一系列工作，結(jié)果顯示IL-1β，一種促炎性細(xì)胞因子，在嚴(yán)重癲癇發(fā)作后神經(jīng)元的異常遷移中扮演了重要角色，且對離體培養(yǎng)的神經(jīng)元遷移具有明顯的導(dǎo)向作用。這一結(jié)果提示IL-1可能參與了腦皮層發(fā)育不良中的神經(jīng)元遷移異常。已有文獻(xiàn)報(bào)道IL-1在腦

3、皮質(zhì)發(fā)育不良患者的腦組織中呈高表達(dá)，但I(xiàn)L-1在腦皮質(zhì)發(fā)育不良形成中的作用，目前未見報(bào)道。
　　目的：
　　本研究擬證實(shí)IL-1在發(fā)育期大鼠腦內(nèi)的表達(dá)模式；觀察下調(diào)其功能受體IL1R1的表達(dá)對新生神經(jīng)元遷移及皮質(zhì)板層結(jié)構(gòu)的影響；進(jìn)而通過觀察放射狀膠質(zhì)的支架結(jié)構(gòu)、新生神經(jīng)元增殖、神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)等可能影響神經(jīng)元遷移的因素來探索IL-1影響神經(jīng)元遷移的機(jī)制；最后對IL-1影響神經(jīng)遷移可能的分子機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　方法：

4、r>　　我們通過γ射線過度輻射孕16天的母鼠，建立腦皮質(zhì)發(fā)育不良的動物模型，并以正常發(fā)育的仔鼠和正常成年大鼠做為對照；之后，通過 RT-PCR及Western檢測IL-1β及IL1R1在發(fā)育期大腦內(nèi)的表達(dá)；接下來，我們應(yīng)用RNA干擾（RNAi）結(jié)合子宮內(nèi)胚胎電轉(zhuǎn)（in utero eletroporation，IUE）技術(shù)，通過免疫組化及western檢測，觀察下調(diào)IL-1R1表達(dá)對新生神經(jīng)元遷移和皮質(zhì)板層結(jié)構(gòu)的影響并探索其可能機(jī)制；最

5、后，我們通過Transwell實(shí)驗(yàn)對IL-1β影響神經(jīng)遷移可能的分子機(jī)制進(jìn)行了初步的探討。
　　結(jié)果：
　　1、孕16天的母鼠接受γ射線過度照射后，有10.7％的仔鼠出現(xiàn)自發(fā)性抽搐發(fā)作，其他仔鼠也表現(xiàn)出不同程度的興奮性行為，組織病理結(jié)果顯示模型組動物的板層結(jié)構(gòu)紊亂、皮質(zhì)變薄，且皮質(zhì)的II/III層、部分海馬的CA2區(qū)、CA3區(qū)出現(xiàn)結(jié)節(jié)樣結(jié)構(gòu)，提示腦皮質(zhì)發(fā)育不良動物模型構(gòu)建成功。
　　2、E17至P7，腦皮質(zhì)發(fā)育不良模型

6、組IL-1β的mRNA水平高于同時期的正常發(fā)育仔鼠組及正常成年大鼠組。隨著時間的延長，腦皮質(zhì)發(fā)育不良組和正常發(fā)育仔鼠組 IL-1β的mRNA表達(dá)呈下降趨勢。直至 P28，IL-1β的mRNA表達(dá)與正常成年大鼠組相比，無明顯差異。進(jìn)一步研究顯示，P0時腦皮質(zhì)發(fā)育不良模型組 IL-1β的蛋白表達(dá)水平高于同期正常發(fā)育仔鼠組合正常成年大鼠組。
　　IL1R1在各組中的mRNA水平和蛋白水平均有表達(dá)，其表達(dá)模式與IL-1β類似。隨著時間的延

7、長，其 mRNA在腦皮質(zhì)發(fā)育不良組和正常發(fā)育仔鼠組的表達(dá)呈下降趨勢，P7時與正常成年大鼠組相比，無明顯差異。在蛋白水平上，三組之間的IL1R1的表達(dá)在P0時無明顯差異。
　　3、Western結(jié)果顯示我們成功構(gòu)建了針對IL1R1的siRNA質(zhì)粒及人IL1R1的過表達(dá)質(zhì)粒。在E16時，我們采用子宮內(nèi)胚胎電轉(zhuǎn)技術(shù)下調(diào)側(cè)腦室神經(jīng)前體細(xì)胞IL1R1的表達(dá)，可觀察到新生神經(jīng)元的遷移出現(xiàn)明顯異常。本應(yīng)遷入皮質(zhì)II/III層的神經(jīng)元，在P5時，

8、大部分（約為62%）仍停留在室旁區(qū)（VZ）、腦室下帶（SVZ）和白質(zhì)（WM）區(qū)域。而同時過表達(dá)該 siRNA序列不能干預(yù)的人 IL1R1后，這一現(xiàn)象可以得到糾正。大部分細(xì)胞（約為84%）仍能正常遷往皮質(zhì)II/III層。
　　4、對影響神經(jīng)元遷移的內(nèi)外因素進(jìn)行分析，我們發(fā)現(xiàn)下調(diào) IL1R1表達(dá)后，對板層結(jié)構(gòu)有輕度的影響，但對神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的支架結(jié)構(gòu)、神經(jīng)細(xì)胞增殖、細(xì)胞形態(tài)等都沒有影響，通過Western檢測IL-1β的在皮質(zhì)各層的分布

9、規(guī)律，我們發(fā)現(xiàn)IL-1β的分布具有明顯的階梯性，提示其可能是通過影響神經(jīng)元的遷移方向來參與了腦皮質(zhì)發(fā)育不良中神經(jīng)元的異常遷移。
　　5、Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：下室添加IL-1β對離體培養(yǎng)的神經(jīng)元胞體的遷移具有明顯的吸引作用，而同時添加一定濃度的艱難梭菌毒素B（RhoA信號通路抑制劑）可逆轉(zhuǎn)這種作用。這一結(jié)果提示IL-1β可能通過RhoA信號通路參與了腦皮質(zhì)發(fā)育不良中的神經(jīng)元異常遷移。
　　結(jié)論：
　　各種原因