Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL17和IL22抗乙肝病毒復(fù)制的體外研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)屬嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae)，基因組長約3.2kb，為部分雙鏈環(huán)狀DNA，可引起人的急、慢性肝炎。長期慢性乙肝病毒感染是肝纖維化，肝硬化及肝癌的高危因素。慢性乙型病毒性肝炎發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，宿主的免疫調(diào)節(jié)紊亂是導(dǎo)致病毒不能有效清除，引起慢性炎癥，病情遷延不愈的重要原因。眾多的細(xì)胞因子不僅參與了機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)，并且具有直接抑制病毒復(fù)制的作用。例如在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模

2、型中已經(jīng)證實(shí)，白細(xì)胞介素(interleukin，IL)6、IL12和IL18等均具有非細(xì)胞毒性的抑制乙肝病毒復(fù)制的作用。IL12和IL2也已有應(yīng)用于慢性乙型病毒性肝炎患者的臨床病例的報(bào)道。IL17和IL22是輔助性T細(xì)胞17(T help cell17，Th17)主要效應(yīng)細(xì)胞因子。目前很多研究證實(shí)Th17參與到急性或慢性肝損害的炎癥反應(yīng)中。有研究表明，在慢性乙肝患者中，血清中IL17的濃度和Th17的數(shù)量與血清中HBV DNA水平呈負(fù)

3、相關(guān);血清中HBV DNA水平與肝臟炎癥水平呈正相關(guān)，而IL22水平與肝臟炎癥水平呈負(fù)相關(guān)。Th17細(xì)胞的細(xì)胞因子IL17和IL22可能具有抑制HBV復(fù)制的作用。實(shí)驗(yàn)選取了在可持續(xù)復(fù)制HBV的肝癌細(xì)胞系HepG2.2.15中進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 抗粘病毒蛋白A(MxA)和2'，5'寡腺苷酸合成酶(OAS)是兩個(gè)重要的抗病毒蛋白，其具有抗多種病毒復(fù)制的作用，包括HBV。MxA在胞漿內(nèi)與病毒的核糖核蛋白復(fù)合物直接結(jié)合，在病毒侵入細(xì)胞的早

4、期抑制病毒復(fù)制。OAS可使ATP聚合成2，5-寡腺苷酸，以激活細(xì)胞內(nèi)核酸酶，降解病毒mRNA，從而抑制病毒蛋白合成。在本實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)一步研究了IL17導(dǎo)致的HBV抑制作用與MxA和OAS的關(guān)系。
　　 第一部分 IL17在肝癌細(xì)胞系HepG2.2.15中抑制HBV復(fù)制的研究
　　 目的:觀察IL17在可持續(xù)分泌HBV的肝癌細(xì)胞系HepG2.2.15中抑制HBV復(fù)制的作用。
　　 方法:分別用不同濃度（4ng/ml、

5、1ng/ml和250pg/ml）的IL17和anti-IL17R Ab(anti-IL17R antibody，anti-IL17R Ab)干預(yù)HepG2.2.15細(xì)胞，CCK8比色法檢測細(xì)胞的增殖情況。分別用含有1ng/ml IL17，1ng/ml抗IL17抗體和1μg/ml阿德福韋酯的細(xì)胞培養(yǎng)液作用于HepG2.2.15細(xì)胞，加藥后3d收集培養(yǎng)上清液，5d收集上清液和細(xì)胞，用Real-time PCR方法檢測上清和細(xì)胞內(nèi)HBV DN

6、A、電化學(xué)發(fā)光方法檢測細(xì)胞上清的HBsAg和HBeAg。應(yīng)用單因素方差分析(One-way analysis of variance，ANVOA)和Dunnett's test用來比較各組間的差別。
　　 結(jié)果:(1)不同濃度水平的IL17組和anti-IL17R Ab組間及與空白對(duì)照組比較HepG2.2.15細(xì)胞CCK8值均無明顯差別（表1-2，P＞0.05）。IL17對(duì)細(xì)胞的增殖無抑制和促進(jìn)作用。
　　 (2) IL

7、17組細(xì)胞內(nèi)HBV DNA水平明顯低于正常對(duì)照組(6.79±0.15，7.14±0.13，P＜005):anti-IL17R Ab組細(xì)胞內(nèi)HBV DNA水平明顯高于正常對(duì)照組(7.47±0.16，7.14±0.13，P＜0.05);阿德福韋酯組細(xì)胞內(nèi)HBVDNA水平明顯低于正常對(duì)照組、IL17組和anti-IL17R Ab組（6.11±0.36，P＜0.05）。
　　 (3)3d和5d時(shí)IL17組細(xì)胞上清液中HBV DNA水平與

8、正常對(duì)照組間無明顯差異(4.67±0.31,4.47±0.34, P＞0.05;4.70±0.34,4.57±0.38, P＞0.05);3d和5d時(shí)anti-IL17R Ab組細(xì)胞上清液中HBV DNA水平明顯高于正常對(duì)照組(5.00±0.21,4.47±0.34,P＜0.05;5.10±0.21,4.57±0.38, P＜0.05);3d和5d時(shí)阿德福韋酯組細(xì)胞上清液HBVDNA水平明顯低于正常對(duì)照組、IL17組和anti-IL17

9、R Ab組(3.59±0.49,P＜0.05;3.35±0.44, P＜0.05)。
　　 (4) IL17組3d時(shí)細(xì)胞上清液中HBsAg水平與正常對(duì)照組比較無明顯差異(9.71±1.55，10.72±0.95，P＞0.05)，5d時(shí)細(xì)胞上清液中HBsAg水平低于正常對(duì)照組(7.56±0.60，9.19±1.20，P＜0.05);anti-IL17RAb組3d時(shí)細(xì)胞上清液HBsAg水平高于正常對(duì)照組(12.78±0.96，10.

10、72±0.95，P＜0.05)，5天時(shí)細(xì)胞上清液HBsAg水平與正常對(duì)照組間無明顯差異(10.72±1.16，9.19±1.20，P＞0.05);3d和5d阿德福韋酯組細(xì)胞上清液HBsAg水平與正常對(duì)照組比較無明顯差異(9.41±1.65,10.72±0.95, P＞0.05;9.78±1.23,9.19±1.20，P＞0.05)。
　　 (5)3d和5d IL17組細(xì)胞細(xì)胞上清液中HBeAg水平低于正常對(duì)照組(34.90±3.

11、68,43.10±5.46，P＜0.05;24.92±6.18,43.95±6.64,P＜0.05);3d和5d anti-IL17R Ab組細(xì)胞上清液HBeAg水平與正常對(duì)照組比較無明顯差異(45.07±4.33,43.10±5.46, P＞0.05;48.31±9.49,43.95±6.64,P＞0.05);3d和5d阿德福韋酯組細(xì)胞上清液HBeAg水平與正常對(duì)照組比較無明顯差異(40.56±6.12,43.10±5.46,P＞0.

12、05;41.51±4.88,43.95±6.64, P＞0.05)。
　　 (6)4ng/ml，1ng/ml，250pg/ml IL17組間比較，細(xì)胞上清液中HBV DNA，HBsAg，HBeAg，細(xì)胞內(nèi)HBV DNA水平均無明顯差異（表1-6，P＞0.05）。第5天IL17可降低細(xì)胞上清液HBsAg水平，第3天IL17無法降低HBsAg水平;第5天IL17對(duì)細(xì)胞上清液HBeAg的抑制率43.31％，第3天對(duì)細(xì)胞上清液HBeAg

13、的抑制率為19.04％。
　　 結(jié)論:IL17對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞增殖無抑制和促進(jìn)作用。IL17可在不產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用的情況下，對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞系內(nèi)的HBV復(fù)制產(chǎn)生抑制作用。IL17的抑制作用在250pg/ml至4ng/ml濃度范圍內(nèi)無濃度依賴性，有時(shí)間依賴性。IL17與阿德福韋酯間抗病毒作用機(jī)制不同。
　　 第二部分 IL22在肝癌細(xì)胞系HepG2.2.15中抑制HBV復(fù)制的研究
　　 目的:探

14、究IL22在可持續(xù)分泌HBV的肝癌細(xì)胞系HepG2.2.15中抑制HBV復(fù)制的作用。
　　 方法:分別用含有不同濃度（4ng/ml、1ng/ml和250pg/ml）的IL22和抗IL22抗體(anti-IL22R antibody，anti-IL22R Ab)干預(yù)HepG2.2.15細(xì)胞，CCK8比色法檢測細(xì)胞的增殖情況。分別用含有1ng/ml IL22，1ng/ml anti-IL22R Ab和1μg/ml阿德福韋酯的細(xì)胞培養(yǎng)

15、液作用于HepG2.2.15細(xì)胞，加藥后3d收集培養(yǎng)上清液，5d收集上清液和細(xì)胞，用Real-time PCR方法檢測上清和細(xì)胞內(nèi)HBV DNA、電化學(xué)發(fā)光方法檢測細(xì)胞上清的HBsAg和HBeAg。應(yīng)用ANVOA和Dunnett's test用來比較各組間的差別。
　　 結(jié)果:(1)不同濃度水平的IL22組和anti-IL22R Ab組間及與空白對(duì)照組比較HepG2.2.15細(xì)胞CCK8值均無明顯差別（表2-1，P＞0.05）。

16、IL22對(duì)細(xì)胞的增殖無抑制和促進(jìn)作用。
　　 (2) IL22組細(xì)胞內(nèi)HBV DNA水與正常對(duì)照組比較無明顯差異(7.28±0.26，7.14±0.13，P＞0.05);anti-IL22R Ab組細(xì)胞內(nèi)HBV DNA水平與正常對(duì)照組比較無明顯差異(7.24±0.17，7.14±0.13，P＞0.05)。
　　 (3)3d和5d時(shí)IL22組細(xì)胞上清液中HBV DNA水平與正常對(duì)照組間無明顯差異(4.87±0.63,4.4

17、7±0.34，P＞0.05;4.68±0.70,4.57±0.38，P＞0.05);3d和5d時(shí)anti-IL22R Ab組細(xì)胞上清液HBV DNA水平與正常對(duì)照組比較無明顯差異(4.70±0.50,4.47±0.34, P＞0.05;4.77±0.33,4.57±0.38, P＞0.05);
　　 (4)3d和5d時(shí)IL22組細(xì)胞上清液中HBsAg水平與正常對(duì)照組比較無明顯差異(11.07±1.15,10.72±0.95, P

18、＞0.05;8.99±0.42,9.19±1.20, P＞0.05);3d和5d時(shí)anti-IL22R Ab組細(xì)胞上清液HBsAg水平與正常對(duì)照組間無明顯差異(9.80±1.50,10.72±0.95，P＞0.05;10.27±1.24,9.19±1.20,P＞0.05)。
　　 (5)3d和5d時(shí)IL22組細(xì)胞細(xì)胞上清液中HBeAg與正常對(duì)照組水平無明顯異常(45.42±6.80,43.10±5.46, P＞0.05;37.8

19、0±7.55,43.95±6.64，P＞0.05);3d和5d時(shí)anti-IL22R Ab細(xì)胞上清液HBeAg水平與正常對(duì)照組比較無明顯差異(40.06±4.29,43.10±5.46, P＞0.05;39.45±6.99,43.95±6.64，P＞0.05)。
　　 結(jié)論:IL22對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞增殖無明顯抑制和促進(jìn)作用，對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞系內(nèi)的HBV復(fù)制無明顯抑制作用。
　　 第三部分 IL17對(duì)H

20、epG2.2.15細(xì)胞內(nèi)部分抗病毒蛋白基因轉(zhuǎn)錄水平的影響
　　 目的:探究ILl7對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)部分抗病毒蛋白基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。探究其與IL17抗HBV作用之間的關(guān)系。
　　 方法:1ng/mllL17干預(yù)HepG2.2.15細(xì)胞。選取部分抗病毒蛋白如抗粘病毒蛋白A(MxA)、2'5'寡腺苷酸合成酶(OAS)、干擾素刺激基因因子3(ISGF3)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子1(STAT1)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因

21、子2(STAT2)，Real-timeRT-PCR方法檢測IL17作用72h后HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)OAS、STAT1、STAT2、ISGF3和MxA基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA水平變化，以β-actin基因mRNA作為檢測內(nèi)參照。用MxAsiRNA和OAS siRNA誘導(dǎo)沉默HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)MxA和OAS基因轉(zhuǎn)錄，Real-timeRT-PCR方法檢測IL17作用下MxA和OAS基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA水平變化，Real-timeP

22、CR方法檢HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)HBV DNA水平變化。應(yīng)用ANVOA和Dunnett's test用來比較各組間的差別。
　　 結(jié)果:(1) IL17作用后HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)MxA和OAS轉(zhuǎn)錄水平與對(duì)照組比值為16.56(P＜0.05)和19.88(P＜0.05);STAT1，STAT2，ISGF3轉(zhuǎn)錄水平與對(duì)照組比值為1.67(P＞0.05)、1.98(P＞0.05)和1.93(P＞0.05)。
　　 (

23、2) MxA siRNA可有效沉默IL17誘導(dǎo)的MxA轉(zhuǎn)錄（沉默效率為82.63％），同步檢測MxA siRNA組細(xì)胞內(nèi)HBV DNA水平較對(duì)照組明顯升高(7.09±0.21，6.76±0.28，P＜0.05)。
　　 (3) OAS siRNA可有效沉默IL17誘導(dǎo)的OAS轉(zhuǎn)錄（沉默效率為81.07％），同步檢測OAS siRNA組細(xì)胞內(nèi)HBV DNA水平較對(duì)照組明顯升高(7.19±0.13，6.76±0.28,P＜0.05)