A2B5+GL261細胞裂解物致敏DC疫苗治療小鼠GL261腦膠質瘤.pdf

1、[目的]
　　 探討腦腫瘤干細胞裂解物致敏DC疫苗對實驗動物腦膠質瘤能否發(fā)揮治療作用。
　　 1.建立小鼠GL261腦膠質瘤原位模型，探討GL261腦膠質瘤的成瘤經過和荷瘤小鼠免疫格局的變化情況；
　　 2.探討GL261細胞的免疫原性和A285+GL261細胞的生物學特征；
　　 3.研究A2B5+GL261細胞裂解物致敏DC疫苗對小鼠GL261腦膠質瘤的治療作用，及其可能的作用機制。
　　 [

2、方法]
　　 1.采用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液在體外培養(yǎng)GL261細胞。采用立體定向注射法將1×105GL261細胞注入同源C57BL/6小鼠右額葉深部，觀察小鼠的表現(xiàn)和生存時間。取瀕死小鼠的全腦作病理學檢查：HE染色和GFAP、Ki-67和CD3免疫組化染色。
　　 2.在C57BL/6小鼠腦內種植1×105GL261細胞后，分別于第4天、第8天、第12天、第16天、第20天、第24天處死3只小鼠，取全腦和脾臟，

3、觀察GL261腦膠質瘤的成瘤經過，研究脾指數(shù)、脾細胞總數(shù)、脾臟T淋巴細胞的變化情況和腫瘤局部CD3+T淋巴細胞的浸潤情況。
　　 3.分別在C57BL/6小鼠和BALB/C-nu裸鼠皮下種植1×106GL261細胞，觀察和比較皮下成瘤情況。采用20GyX射線輻射滅活GL261細胞作為疫苗接種到C57BL/6小鼠皮下，預防性接種組：第0天、第7天兩次在C57BL/6小鼠皮下接種1×106輻射滅活GL261疫苗，第12天在小鼠腦內種

4、植1×105GL261細胞；治療性接種組：第0天在C57BL/6小鼠腦內種植1×105GL261細胞，第7天、第14天、第21天三次在小鼠皮下接種1×106輻射滅活GL261疫苗，比較小鼠的生存時間和腦內成瘤情況。流式檢測GL261細胞H-2Kb和H-2I-Ab分子的表達情況。
　　 4.采用含20ng/mL EGF、20ng/mL bFGF、2％B27的DMEM/F12無血清培養(yǎng)液在體外培養(yǎng)GL261細胞，流式分選獲取A2B5

5、+和A2B5-GL261細胞。進行體外單細胞克隆形成實驗，比較A2B5+和A2B5-GL261細胞的克隆形成能力。進行體內成瘤實驗：A2B5+GL261細胞按照1×104、1×103、1×102細胞數(shù)量梯度進行種植，A2B5-GL261細胞組按照1×105、1×104、1×103細胞數(shù)量梯度進行種植，比較A2B5+和A2B5-GL261細胞的成瘤能力。
　　 5.采用含15％FBS、10ng/mL mGM-CSF、10ng/mL

6、 mIL-4的RPMI1640培養(yǎng)液在體外培養(yǎng)小鼠骨髓DC細胞。采用反復凍融法裂解A2B5+和A2B5-GL261細胞，并用以致敏DC制備疫苗。致敏DC與脾臟T淋巴細胞共培養(yǎng)，通過CFSE/PI流式檢測作體外殺傷實驗研究。干預分成兩種：成瘤前干預第0天在C57BL/6小鼠腦內種植1×105GL261細胞，第2天、第9天、第16天三次在皮下接種含1×106A2B5+或A2B5-GL261細胞裂解物致敏DC疫苗進行治療；成瘤后干預第0天在C

7、57BL/6小鼠腦內種植1×105GL261細胞，第12天、第19天、第26天三次在皮下接種含1×106A2B5+或A2B5-GL261細胞裂解物致敏DC疫苗進行治療，比較小鼠的生存時間和腦內成瘤情況。采用RT-RCR檢測A2B5+和A2B5-GL261細胞內gp100和TRP-2基因的表達情況。
　　 [結果]
　　 1.C57BL/6小鼠腦內種植1×105GL261細胞，可以獲得百分之百的腦內成瘤，小鼠生存時間為3～

8、4周，重復性好。GL261腦膠質瘤具有很強的侵襲性，能夠模擬人腦膠質母細胞瘤。
　　 2.C57BL/6小鼠腦內種植1×105GL261細胞后，早期腦內無成形的腦膠質瘤，第12天開始出現(xiàn)成形的腦膠質瘤，其后腫瘤進行性增大，直至小鼠死亡。早期小鼠的免疫系統(tǒng)被激活，表現(xiàn)為脾指數(shù)的上升和脾細胞總數(shù)的增多；成瘤后小鼠呈現(xiàn)免疫耐受，表現(xiàn)為脾指數(shù)和脾細胞總數(shù)的恢復；終末期小鼠的免疫系統(tǒng)被抑制，表現(xiàn)為脾指數(shù)的下降和脾細胞總數(shù)的減少，Treg細

9、胞比例上升。剛成形的GL261腦膠質瘤內有明顯的T淋巴細胞浸潤，終末期的GL261腦膠質瘤內僅有零星的T淋巴細胞浸潤。
　　 3.C57BL/6小鼠皮下種植1×106GL261細胞后，GL261細胞被包裹局限化或被排斥。預防性接種輻射滅活GL261疫苗，能夠阻止75％C57BL/6小鼠腦內成瘤；治療性接種輻射滅活GL261疫苗，不能延長小鼠生存時間。GL261細胞低表達H-2Kb和H-2I-Ab分子。
　　 4.無血清培

10、養(yǎng)GL261細胞中，A2B5+GL261比例為10.36％。單細胞克隆形成實驗發(fā)現(xiàn)：A2B5+GL261單細胞克隆形成率為11.5％，A2B5-GL261也能夠增殖，但不能形成克隆。1×103A2B5+GL261即能在C57BL/6小鼠腦內成瘤，1×105A2B5-GL261也不能在C57BL/6小鼠腦內成瘤。
　　 5.A2B5+和A2B5-GL261細胞裂解物都能致敏小鼠骨髓DC。A2B5+GL261細胞裂解物致敏DC誘導的

11、CTL對A2B5-和A2B5+GL261細胞都有殺傷作用，A2B5-GL261細胞裂解物致敏DC誘導的CTL對A2B5-GL261細胞有殺傷作用，對A2B5+GL261細胞的殺傷作用較弱。成瘤前干預接種A2B5+GL261細胞裂解物致敏DC疫苗能夠延長小鼠生存時間，并阻止37.5％的小鼠腦內成瘤，接種A2B5-GL261細胞裂解物致敏DC疫苗能夠延長小鼠生存時間，但不能阻止小鼠腦內成瘤；成瘤后干預接種A2B5+或A2B5-GL261細胞

12、裂解物致敏DC疫苗都不能延長小鼠生存時間。TRP-2基因在A2B5+GL261細胞內的表達明顯高于A2B5-GL261細胞。
　　 [結論]
　　 小鼠GL261腦膠質瘤原位模型重復性好，能夠模擬人腦膠質母細胞瘤，但GL261細胞具有中等的免疫原性。荷瘤小鼠經歷了早期的免疫激活、成瘤后的免疫耐受和終末期的免疫抑制三個階段。A2B5+GL261細胞具有腦腫瘤干細胞樣特征。A2B5+GL261細胞裂解物致敏DC疫苗在體外和在

13、體內的作用，都優(yōu)于A2B5-GL261細胞裂解物致敏DC疫苗
　　 [創(chuàng)新點]
　　 1.對GL261腦膠質瘤原位模型小鼠免疫格局的變化作了初步探討，并提出荷瘤小鼠的免疫格局經歷了三個階段：早期的免疫激活狀態(tài)，成瘤后的免疫耐受狀態(tài)，以及終末期嚴重的免疫抑制狀態(tài)。
　　 2.首次報道采用神經膠質前體細胞標志A2B5，對已經建系的小鼠GL261腦膠質瘤細胞株內的腦腫瘤干細胞進行了研究，并提出A2B5+GL261細胞具