隨機siRNA文庫的構(gòu)建及其在基因組范圍內(nèi)高通量篩選胃癌表柔比星耐藥相關(guān)基因中的應(yīng)用.pdf

1、胃癌是我國常見的惡性腫瘤,發(fā)病率和死亡率都很高。ECF方案(表柔比星、順鉑和5-氟尿嘧啶)是治療胃癌的標(biāo)準(zhǔn)化療方案之一。但是多藥耐藥(multidrug resistance, MDR)的出現(xiàn),往往使胃癌化療失敗。順鉑和5-氟尿嘧啶的耐藥機制已經(jīng)有很多的報道,但是關(guān)于胃癌表柔比星耐藥相關(guān)分子目前還知之甚少。
　　本實驗室在建立了胃癌MDR細(xì)胞亞系的基礎(chǔ)上,應(yīng)用抑制消減雜交和差異顯示PCR等基于基因型的篩選方法,成功篩選出了一些MD

2、R相關(guān)基因。但是胃癌耐藥的機制很復(fù)雜,應(yīng)用這種基于基因型的篩選方法獲得的基因仍然很難完全闡明耐藥發(fā)生的機制,而且這些分子與耐藥的發(fā)生是因果關(guān)系、果因關(guān)系或僅為伴隨現(xiàn)象很難確定。簡約化原則是生物體生物學(xué)功能完成過程中的統(tǒng)一原則,理論上耐藥的發(fā)生不可能是大量的、無規(guī)則的細(xì)胞事件,而應(yīng)是在一定規(guī)律調(diào)控下的有序過程,換言之,耐藥發(fā)生的調(diào)控應(yīng)是受數(shù)個關(guān)鍵分子調(diào)控的結(jié)果。
　　因此,以功能為基礎(chǔ),采用基于表型的高通量篩選方法來獲得耐藥相關(guān)的重

3、要基因,探索眾多分子之間點與點、面與面、立體的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控作用,來闡明耐藥發(fā)生的分子機制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)就顯得十分重要。雙鏈小干擾RNA(siRNA)可以在多種類型的細(xì)胞中介導(dǎo)特異性的基因沉默作用,這一現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)為深入研究單個基因的功能提供了重要的方法學(xué)基礎(chǔ),從而得到了廣泛的應(yīng)用。最近的文獻(xiàn)報道了全基因組siRNA文庫的建立,為高通量基因功能分析和研究提供了新的方法,成為新的研究熱點。siRNA文庫可以用來篩選和研究介導(dǎo)復(fù)雜細(xì)胞表型和生物學(xué)過程的

4、關(guān)鍵基因,通過建立一系列具有目的表型的細(xì)胞系,有可能對特定細(xì)胞信號調(diào)節(jié)通路進(jìn)行更為全面的解析。
　　因此,我們認(rèn)為利用siRNA文庫的篩選方法可以篩選出表達(dá)水平被特異siRNA下調(diào)后引起胃癌單藥甚至是多藥耐藥的基因。siRNA文庫為胃癌耐藥的研究提供了新的手段,為全面理解腫瘤耐藥的機制帶來了新的契機。新的胃癌多藥耐藥基因的發(fā)現(xiàn)和研究,將為胃癌的治療提供新的靶點。表柔比星是最常用的胃癌標(biāo)準(zhǔn)化治療方案ECF的組成藥物之一,對表柔比星耐

5、藥相關(guān)基因進(jìn)行篩選和研究,相對來說更為貼近臨床。本課題將對此進(jìn)行探討。
　　【目的】：1、構(gòu)建部分隨機siRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒文庫;2、在胃癌細(xì)胞系SGC7901中篩選胃癌表柔比星耐藥相關(guān)基因;3、探討候選靶基因在胃癌耐藥中的作用及其可能的分子機制。
　　【方法】：1、利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建小干擾RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體,采用Western Blot、MTT和熒光顯微鏡觀察對其功能進(jìn)行驗證。2、按照文獻(xiàn)報道的設(shè)計有效siRNA的法

6、則,合成部分隨機的siRNA庫引物以及短片段的延伸引物,通過大規(guī)模的退火、第二鏈延伸、酶切、純化、連接以及轉(zhuǎn)化等步驟建立部分隨機的siRNA質(zhì)粒文庫,并包裝為逆轉(zhuǎn)錄病毒。3、將此病毒文庫感染胃癌細(xì)胞SGC7901,加入表柔比星進(jìn)行篩選。然后收集存活細(xì)胞,提取基因組DNA,通過PCR釣取功能siRNA分子,通過生物信息學(xué)分析獲得胃癌耐藥的相關(guān)基因。4、通過Realtime RT-PCR、Western Blot、MTT、流式細(xì)胞術(shù)等方法對

7、候選基因進(jìn)行功能驗證,并探討其介導(dǎo)胃癌耐藥的可能機制。
　　【結(jié)果】：1、成功構(gòu)建了siRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體我們將逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體PBMN-Z和逆轉(zhuǎn)錄病毒嵌合表達(dá)載體PBMN-GFP分別雙酶切后進(jìn)行連接,構(gòu)建出新的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pRetroGFP,使其不但具有逆轉(zhuǎn)錄病毒的表達(dá)元件,而且可以表達(dá)綠色熒光蛋白GFP,以便于后續(xù)的篩選和監(jiān)測工作。同時,我們將促細(xì)胞周期進(jìn)展分子Cdc2 siRNA的特異性寡核苷酸克隆到siRNA

8、表達(dá)載體Phippy中,構(gòu)建成pHippy-Cdc2,然后通PCR的方法擴增出Cdc2的序列和siRNA的表達(dá)圖框,最后和pRetroGFP連接,構(gòu)建成新的小干擾RNA逆轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體psiRNA-Cdc2。因此,我們構(gòu)建好的siRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體來源于三個不同的載體:PBMN-Z、PBMN-GFP和Phippy。為了提高逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染效率,我們將Ecotropic receptor轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)胞,建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系SG

9、C7901-rec。然后,將psiRNA-lib-Cdc2和psiRNA-lib-cont分別轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞PhoenixTM Eco,包裝為逆轉(zhuǎn)錄病毒。將病毒分別感染SGC7901-rec細(xì)胞,并分別命名為SGC7901/siCdc2和SGC7901/cont細(xì)胞系。接著我們驗證了構(gòu)建的siRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的有效性。病毒感染后48小時,我們利用Western blot檢測了Cdc2分子的表達(dá),結(jié)果提示,Cdc2在SGC7901/

10、siCdc2中的表達(dá)較對照細(xì)胞SGC7901/cont顯著下調(diào)。MTT實驗也證實,SGC7901/siCdc2較對照細(xì)胞SGC7901/cont的生長速度明顯減慢。感染后72小時對兩種細(xì)胞進(jìn)行熒光顯微鏡觀察,根據(jù)綠色熒光蛋白GFP的表達(dá)情況,病毒的感染效率約為20％,同時,通過光學(xué)顯微鏡下的細(xì)胞計數(shù)發(fā)現(xiàn),SGC7901/siCdc2較SGC7901/cont的細(xì)胞數(shù)目顯著減少,增殖顯著減慢。2、隨機siRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒文庫的構(gòu)建首先進(jìn)行

11、了小片段雙鏈DNA的制備:按照文獻(xiàn)報道的設(shè)計有效siRNA的法則,合成部分隨機siRNA庫引物和小片段延伸引物,并進(jìn)行引物的退火。我們發(fā)現(xiàn)退火產(chǎn)物直接加入Klenow進(jìn)行延伸,效率高于Qiagen Nucleotide removal kit純化退貨產(chǎn)物后再進(jìn)行延伸。通過比較發(fā)現(xiàn),Klenow和PCR的延伸效果類似,以PCR法略優(yōu),因此本研究將采用PCR法進(jìn)行引物的延伸。庫引物和延伸引物的摩爾比為1:10左右的時候延伸效率最高。檢測發(fā)現(xiàn)

12、50μl的PCR反應(yīng)體系中,2μl的Taq酶較5μl的Taq酶的延伸效果好。PCR延伸后的DNA雙鏈片段大小為55bp。經(jīng)Sal ?和Cla ?酶切后的雙鏈小片段即為目的小片段,由Qiagen Nucleotide removal kit純化,該試劑盒的小片段回收效率為40％。質(zhì)粒psiRNA-lib-Cdc2也進(jìn)行Sal ?和Cla ?雙酶切。為了防止雙酶切后的大片段和原載體不易區(qū)分,我們將酶切產(chǎn)物和另外一個較大片段進(jìn)行連接后再進(jìn)行雙

13、酶切。Sal ?和Cla ?雙酶切的產(chǎn)物經(jīng)過定量為50ng/μl。載體和片段制備成功后,進(jìn)行預(yù)連接。我們發(fā)現(xiàn),當(dāng)載體和片段的比例為1:10的時候連接效率最高,50ng的載體在10cm的平皿約轉(zhuǎn)化出8×103個克隆,50ng的自連載體在10cm的平皿約轉(zhuǎn)化出50個克隆。最后進(jìn)行大規(guī)模的連接,總共連接500個10cm的平皿,構(gòu)建了庫容為4×106的隨機siRNA質(zhì)粒文庫。文庫的構(gòu)建重復(fù)了8次。文庫構(gòu)建完畢后,我們隨機挑取96個克隆,進(jìn)行Ec

14、oR ?酶切鑒定,有效克隆數(shù)為91％。隨機挑取20個克隆進(jìn)行測序,除了一個克隆沒有片段插入,一個克隆出現(xiàn)TTTTT的終止信號,其余18個克隆均正確的插入了序列唯一的siRNA片段,平均GC含量為41.1％。3、利用隨機siRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒文庫篩選胃癌表柔比星耐藥相關(guān)基因48μg的隨機siRNA質(zhì)粒文庫轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞后包裝為逆轉(zhuǎn)錄病毒,感染SGC7901-rec細(xì)胞,加入表柔比星進(jìn)行篩選。感染后2周出現(xiàn)第一批耐表柔比星的存活克隆。文庫的篩選

15、共持續(xù)了8周。在整個篩選過程中,文庫組和對照組完全平行操作。對照組篩選后沒有存活克隆出現(xiàn)。以上的文庫篩選過程共重復(fù)了8次。將文庫組篩選后存活的細(xì)胞提取基因組DNA,利用siRNA表達(dá)框兩端的引物序列進(jìn)行PCR擴增,測序后,共獲得12個siRNA分子。MTT檢測顯示這12條siRNA分子的轉(zhuǎn)染都可以不同程度的降低SGC7901-rec細(xì)胞對表柔比星的敏感性,其中siRNA001和siRNA003最為顯著。siRNA001轉(zhuǎn)染細(xì)胞的IC50

16、是對照細(xì)胞的4.3倍,而siRNA003轉(zhuǎn)染細(xì)胞的IC50是對照細(xì)胞的3.9倍,提示siRNA001和siRNA003可能參與了胃癌細(xì)胞對表柔比星的耐藥。經(jīng)BlAST分析,siRNA001和siRNA003分別和人類GAS1基因(growth arrest-specific 1)和PTEN基因(phosphatase and tensin homolog)的靶mRNA序列有很高的同源性。而其它10個siRNA分子沒有找到對應(yīng)的靶基因。s

17、iRNA001的正義鏈(TTCATTTCCATGAAGCCACCG)和GAS1基因(NM002048.1) mRNA序列的204-224位點(TTCATTTCCAGGAAGCCACCG)有95％的同源性,其中有一個堿基不匹配(11位為T,而不是G)。siRNA003的正義鏈(TTTAACTGTATTATTTGGCAG)和PTEN基因(NM000314.4) mRNA序列的5221-5241位點(TTTAACTGTAGTATTTGGCAG

18、)有95％的同源性,其中有一個堿基不匹配(11位為T,而不是G)。Real-time RT-PCR和western blot的檢測證實, GAS1在SGC7901/siGAS1(轉(zhuǎn)染了完全匹配的GAS1 siRNA)和SGC7901/ siGAS1 (+)(轉(zhuǎn)染了有一個堿基突變的GAS1 siRNA)細(xì)胞系中的表達(dá)顯著下調(diào),較對照細(xì)胞系SGC7901/cont降低80％以上。提示我們篩選出來的有一個堿基突變的siRNA分子可以和完全匹配

19、的siRNA分子一樣可以顯著的抑制細(xì)胞中GAS1的表達(dá)。MTT實驗證實下調(diào)GAS1的表達(dá)可以顯著降低SGC7901細(xì)胞對表柔比星的敏感性。PTEN的研究結(jié)果和GAS1相似。4、GAS1的表達(dá)下調(diào)促進(jìn)胃癌多藥耐藥的發(fā)生我們利用Western Blot檢測了不同胃癌細(xì)胞系(SGC7901、MKN45、AGS和MKN28)中GAS1的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)GAS1在AGS和MKN28細(xì)胞系中的表達(dá)較低,因此我們選取這兩種細(xì)胞來上調(diào)GAS1的表達(dá)。

20、r>　　【結(jié)論】：我們首次構(gòu)建了一個部分隨機的siRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒文庫，并利用這一高通量篩選技術(shù)，對胃癌表柔比星耐藥相關(guān)基因進(jìn)行了表型為基礎(chǔ)的功能篩選。通過篩選，我們發(fā)現(xiàn)了一個新的胃癌表柔比星耐藥相關(guān)基因GAS1，GAS1基因的表達(dá)下調(diào)可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞對表柔比星的耐藥，甚至是多藥耐藥（具體一點）。我們同時對其介導(dǎo)耐藥的可能機制進(jìn)行了探討（具體一點）。該文庫為胃癌耐藥的研究提供了新的手段，為全面理解腫瘤耐藥的機制帶來了新的契機。新的胃癌多