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文檔簡介
1、目的:
探討在小鼠胚胎心內膜細胞中Calcineurin/NFATcl信號通路對FGFRl表達和胚胎心內膜細胞增殖的影響。
方法:
(1)取E11.5的小鼠胚胎,免疫組化方法檢測NFATcl的陽性表達。分離并原代培養(yǎng)小鼠胚胎E11.5心內膜細胞(ECC)。分離的胚胎心內膜細胞(ECC)加入M199培養(yǎng)液,并加入20%胎牛血清(FBS),37℃?zhèn)鞔囵B(yǎng),倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)及生長情況。進行ECC
2、細胞爬片,應用免疫熒光染色法鑒定。固定的ECC經(jīng)PBS洗滌后,在含0.2%TritonX-100中通透10min。5%牛血清白蛋白室溫封閉30min后,與一抗在4℃孵育過夜。一抗為ANTI-NFATcl。二抗為異硫氰酸熒光素標記抗體。
(2)應用CSA抑制或應用PMA+Ionomycin激活ECC細胞Calcineurin/NFATcl信號通路后來研究對FGFRl表達的影響。提取總RNA,以GAPDH為內參,進行RT-PC
3、R反應,通過光密度掃描進行半定量分析。傳代培養(yǎng)小鼠胚胎心內膜細胞,給予不同劑量的PMA+Ionomycin、CSA作用細胞不同時間(1、2、3、4d),CCK-8法檢測不同濃度藥物對小鼠胚胎心內膜細胞增殖的影響。
(3)通過PCR擴增FGFRl目的片段,雙酶切純化PCR產(chǎn)物及pcDNA3.1a,將擴增的FGFRl基因片段插入pcDNA3.1a線性質粒,即構建成pcDNA3.1a-FGFRl真核表達質粒,將質粒轉化感受態(tài)細胞
4、DH5a,篩選陽性克隆行雙酶切鑒定及測序鑒定。
結果:
(1)NFATcl通過免疫組化法在胚胎心內膜呈現(xiàn)定位清晰的淡黃色至棕褐色顆粒狀著色。凍存細胞復蘇后,增殖能力強,和傳代細胞具有相似的生長特性。ECC細胞通過免疫熒光染色法顯綠色熒光。
(2)應用CSA抑制ECC細胞中Calcineurin/NFATcl信號通路后FGFRl的表達下調;應用PMA+Ionomycin激活ECC細胞中Calcin
5、eurin/NFATcl信號通路后FGFRl的表達上調。CSA可顯著抑制小鼠胚胎心內膜細胞的增殖,PMA+Ionomycin可顯著促進小鼠胚胎心內膜細胞的增殖,并且在藥物濃度和時間上呈劑量依賴性和時間依賴性關系。
(3)酶切及測序結果表明pcDNA3.1a-FGFRl真核表達質粒構建成功。
結論:
(1)NFATcl在胚胎心內膜陽性表達。小鼠胚胎心內膜細胞培養(yǎng)成功。本實驗通過培養(yǎng)小鼠胚胎心內膜細
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