增生性瘢痕退行性變相關(guān)基因群的篩選及實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、瘢痕過度增殖形成的增生性瘢痕長期不退化不僅明顯破壞人的體表完美，造成疼痛難忍、瘙癢不適等癥狀，甚者導(dǎo)致嚴(yán)重功能障礙，生活難以自理。通常增生性瘢痕早期增生活躍，癥狀嚴(yán)重，造成患者極大身心痛苦，后期由于增生性瘢痕發(fā)性退行性變，瘢痕趨于成熟穩(wěn)定，其不適癥狀明顯緩解。如何促使過度增生的瘢痕及早進(jìn)入成熟穩(wěn)定階段是臨床亟待解決的難題。增生性瘢痕的退行性變是一個(gè)錯(cuò)綜復(fù)雜的多因素、多階段、多基因共同作用的過程，闡明增生性瘢痕退行性變的分子生物學(xué)基礎(chǔ)和機(jī)

2、理，是整形外科領(lǐng)域的一個(gè)重要課題，而在基因水平上從增生性瘢痕退行性變這一角度對瘢痕機(jī)理和防治進(jìn)行深入研究，尚未見報(bào)道。 [目的] 應(yīng)用基因芯片技術(shù)從基因水平探索增生性瘢痕退行性變的機(jī)制，篩選出調(diào)控增生性瘢痕從過度增殖向成熟穩(wěn)定期轉(zhuǎn)化的退行性變相關(guān)基因群，并對退行性變相關(guān)基因進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。 [方法] (1)收集8例同一患者不同生長時(shí)期(增殖活躍階段和成熟穩(wěn)定階段)的增生性瘢痕組織標(biāo)本，按一步法抽提出增生期和

3、穩(wěn)定期的瘢痕組織總RNA，純化mRNA，分別制成Cy3和Cy5熒光標(biāo)記cDNA探針，與含有14112個(gè)cDNA的高密度基因微矩陣芯片(BiostarH-140s)雜交，選取差異表達(dá)顯著的cDNA片段，到NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索和比對，對獲得全長基因，進(jìn)行計(jì)算機(jī)生物信息學(xué)分析，篩選出增生性瘢痕退行性變相關(guān)的已知和未知基因群。 (2)應(yīng)用TUNEL、免疫組織化學(xué)、原位雜交、RT-PCR、細(xì)胞圖像分析等方法，對篩選出的增生性瘢痕退行性變相

4、關(guān)基因群中的豐度高、Ratio值大的感興趣基因進(jìn)行原位表達(dá)比較及蛋白功能檢測，以探討其在增生性瘢痕退行性變過程中的變化規(guī)律和內(nèi)在聯(lián)系。 [結(jié)果] (1)資料分析表明，在14112個(gè)基因中，退變后穩(wěn)定期的增生性瘢痕組織與增殖活躍的增生性瘢痕組織之間存在差異表達(dá)基因。按照Scanarray4000掃描Ratio值大于2或小于0.5作為基因點(diǎn)，共篩選出增生性瘢痕退行性變差異表達(dá)基因840條，其中上調(diào)基因438條，下調(diào)基因362

5、條，新基因102條。包括細(xì)胞凋亡基因、原癌基因和抑癌基因、離子通道和運(yùn)輸?shù)鞍住⒓?xì)胞骨架和運(yùn)動(dòng)基因、DNA合成和修復(fù)重組蛋白、細(xì)胞受體、免疫相關(guān)、細(xì)胞信號和傳遞蛋白、代謝蛋白、翻譯合成、發(fā)育相關(guān)等多種基因參與增生性瘢痕退行性變。 (2)TUNEL(DNA末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記dUTP)檢測表明，發(fā)生退行性變的成熟期增生性瘢痕凋亡過度，而增殖活躍的增生期的增生性瘢痕不足，二者凋亡指數(shù)(apoptosisindex，Al)分別為26.51±1

6、1.07和8.25±2.74(P＜0.01)。免疫組化和原位雜交結(jié)果顯示，在成熟退變的增生性瘢痕組織中Caspase3呈強(qiáng)陽性，而在增生期的增生性瘢痕組織中Caspase3呈弱陽性或陰性；成熟期的增生性瘢痕中TGFβ3和TGFRⅡ的表達(dá)強(qiáng)度強(qiáng)于增生期，而TGFβ1、TGFβ2和TGFRⅠ的表達(dá)強(qiáng)度則相反。 [結(jié)論] 增生性瘢痕的退行性變是包括細(xì)胞凋亡基因、原癌基因和抑癌基因、離子通道和運(yùn)輸?shù)鞍住⒓?xì)胞骨架和運(yùn)動(dòng)基因、DNA