燒傷后增生性瘢痕相關基因P311功能的初步研究.pdf

1、本研究擬從如下三方面研究P311在增生性瘢痕形成中的可能作用：①P311基因及蛋白在增生性瘢痕組織中的分布，以了解何種細胞在瘢痕組織中高表達P311基因及蛋白，為下一步鎖定研究何種細胞奠定基礎；②向靶細胞導入P311基因，以觀察靶細胞在此基因作用下的功能變化和細胞周期變化；③干擾靶細胞P311基因的表達，以觀察靶細胞的功能變化。通過上述三方面的工作，以期闡明P311基因在增生性瘢痕形成和病理變化中的作用。 研究內(nèi)容:1.P311

2、基因及其蛋白在燒傷后不同時期增生性瘢痕組織中的定位分布表達(1)用原位雜交技術檢測燒傷后增生性瘢痕組織中P311mRNA定位分布表達。 (2)用免疫組化檢測P311蛋白在燒傷后增生性瘢痕組織中的定位表達。制備兔抗人P311抗體，然后用該抗體進行免疫組化實驗，檢測P311蛋白在燒傷后增生性瘢痕組織中的定位表達。 (3)RT-PCR檢測P311mRNA在不同組織胚層來源細胞中的表達。原代分離培養(yǎng)人皮膚來源成纖維細胞、燒傷后增

3、生性瘢痕來源成纖維細胞、正常皮膚來源表皮細胞、正常人外周血單個核細胞、正常人骨髓間充質(zhì)干細胞；分別提取上述細胞的總RNA，然后用RT-PCR技術檢測P311mRNA在上述細胞中的表達。 2.上調(diào)表達P311基因后成纖維細胞的生物特性變化(1)構建并鑒定表達人源P311基因的重組復制缺陷型腺病毒載體。 (2)利用腺病毒載體將人源P311基因?qū)胝Ｆつw及增生性瘢痕組織來源的成纖維細胞。 (3)利用FPCL模型(Fi

4、broblast-PopulatedCollagenLattice)，即成纖維細胞的三維培養(yǎng)系統(tǒng)，觀察的收縮能力變化。 (4)用RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染P311基因前后成纖維細胞表達α-SMA、TGF-β1、α1(Ⅰ)collagengene(COL1A1)mRNA的變化。 3.抑制P311基因表達后成纖維細胞的生物學特性變化(1)設計并構建針對人P311基因的siRNA質(zhì)粒HK、MB1、MB2、MB3。 (2)用F

5、uGene6轉(zhuǎn)染試劑將上述質(zhì)粒導入瘢痕來源成纖維細胞中，根據(jù)綠色熒光蛋白的表達觀察轉(zhuǎn)染效率，其后在G418壓力下篩選穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的細胞克隆，并擴增培養(yǎng)。RT-PCR及WesternBlot檢測RNA干擾效率，選擇干擾效率最佳的細胞進行后續(xù)實驗。 (3)利用FPCL模型觀察抑制P311基因表達后，瘢痕來源成纖維細胞的收縮能力變化。 (4)用RT-PCR檢測抑制P311基因前后瘢痕來源成纖維細胞表達TGF-β1的變化

6、。 結論:1.P311mRNA及蛋白表達于增生性瘢痕組織真皮層內(nèi)的成纖維細胞的細胞漿中，而在皮膚表皮細胞、正常皮膚組織來源成纖維細胞、增生性瘢痕組織來源成纖維細胞、外周血單個核細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞中不表達。這些細胞在真皮層內(nèi)聚集成團，并被旋渦狀的、粗大紊亂的膠原纖維所包繞。這些細胞主要出現(xiàn)于燒傷后早期的增生性瘢痕組織中，隨著瘢痕的成熟、軟化，表達P311基因的成纖維細胞數(shù)量明顯減少，最后消失。 2.成功制備了攜帶hP3

7、11基因的重組復制缺陷型腺病毒，為進一步研究P311基因的功能奠定了實驗基礎，。 3.成功制備了針對hP311基因的siRNA質(zhì)粒，為深入研究P311基因的功能奠定了實驗基礎。 4.從細胞表面標志、細胞分泌的細胞因子、膠原蛋白類型變化以及細胞增殖變化、細胞生物學行為改變上看，轉(zhuǎn)染P311基因可以促進成纖維細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，并可能在增生性瘢痕形成過程中發(fā)揮了一定的作用。 5.基于上述實驗結果，我們提出如下假說

8、：P311蛋白可能通過PEST結構域作用于泛素-蛋白酶體通路，抑制增生性瘢痕成纖維細胞內(nèi)TGF-β信號通路中Smad蛋白的降解，導致Smad蛋白在細胞內(nèi)堆積，出現(xiàn)胞內(nèi)TGF-β信號的異常放大，從而可能使成纖維細胞對TGF-β等細胞因子的敏感性明顯增加，并可能使增生性瘢痕內(nèi)成纖維細胞表型發(fā)生肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，使其表達α-SMA、分泌TGF-β1、COL1A1增加，細胞分裂增殖增加，細胞收縮能力也明顯增強；同時，P311蛋白還通過促進成纖維