利用含T淋巴細(xì)胞和鏈球菌抗原的無血清培養(yǎng)基體外建立銀屑病皮損模型.pdf

1、目的：研究體外培養(yǎng)銀屑病皮損的方法，改良銀屑病活體器官模型，利用建立的銀屑病活體器官模型，用以研究和探索銀屑病的病因、發(fā)病機理、進行藥物篩選及藥物臨床前治療預(yù)實驗。檢測銀屑病皮損中特異性角蛋白表達及細(xì)胞因子含量，確立鑒定銀屑病皮損的檢測特征性指標(biāo)。探討銀屑病外周血中T細(xì)胞，鏈球菌抗原，角蛋白17及細(xì)胞因子INF-γ、TNF-α、IL-8在銀屑病發(fā)病機制中的作用及相互聯(lián)系。 方法：模擬人體銀屑病發(fā)病機制，自制簡易氣液平面體外培養(yǎng)裝

2、置，利用加入銀屑病患者外周血T淋巴細(xì)胞及β-溶血性鏈球菌抗原的無血清培養(yǎng)基進行體外銀屑病皮損培養(yǎng)；通過肉眼觀察，HE染色法光鏡觀察，透射電鏡觀察，觀測體外培養(yǎng)銀屑病皮損的活性及組織學(xué)形態(tài)；利用免疫組化方法及蛋白質(zhì)印跡免疫分析技術(shù)，對照正常皮膚，半定量檢測培養(yǎng)前后銀屑病皮損中角蛋白K17表達；利用酶聯(lián)接免疫吸附劑檢測不同條件、不同病例中細(xì)胞因子INF-γ、 TNF-α、IL-8含量，并對所測數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。 結(jié)果：（1）通過光

3、鏡，透射電鏡下觀察，利用加入銀屑病患者外周血T淋巴細(xì)胞及β-溶血性鏈球菌抗原的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)6天后的銀屑病皮損仍保持完整的銀屑病皮膚組織形態(tài)學(xué)特征；而單純無血清培養(yǎng)則無法維持銀屑病皮損特征；正常皮膚利用加入銀屑病患者外周血T淋巴細(xì)胞及β-溶血性鏈球菌抗原的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)6天后也出現(xiàn)銀屑病樣特點。（2）免疫組化結(jié)果，角蛋白17在培養(yǎng)前后銀屑病皮損中強陽性表達；同一病例培養(yǎng)前后銀屑病皮損中角蛋白17含量無顯著性差異（P>0.05），但與

4、正常對照相比，有顯著性差異（P<0.01）；正常皮膚在加入銀屑病患者外周血T淋巴細(xì)胞及β-溶血性鏈球菌抗原的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)6天后，表皮也出現(xiàn)K17弱陽性表達；（3）蛋白質(zhì)印跡免疫結(jié)果分析，SDS-PAGE電泳結(jié)果，對照藍(lán)色預(yù)染低分子量蛋白Marker，估計K17分子量大約為46kDa；Western Blotting結(jié)果顯示，培養(yǎng)前后銀屑病皮損樣本較正常對照出現(xiàn)明顯角蛋白17陽性條帶；（4）ELISA結(jié)果，不同培養(yǎng)條件下的銀屑病皮損I

5、L-8、INF-γ、TNF-α出現(xiàn)陽性表達，而正常對照未培養(yǎng)皮膚中幾乎無上述細(xì)胞因子表達；利用加入銀屑病患者T淋巴細(xì)胞及β-溶血性鏈球菌抗原的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的銀屑病皮損，各細(xì)胞因子含量維持在同一水平，而單純用無血清培養(yǎng)及用僅加入外周血T細(xì)胞培養(yǎng)的銀屑病皮損與同一病例培養(yǎng)前相比，各細(xì)胞因子含量顯著下降（P<0.05）；正常皮膚組織在加入銀屑病患者淋巴細(xì)胞及β-溶血性鏈球菌抗原的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)6天后，組織勻漿中INF-γ、TNF-α、I

6、L-8較培養(yǎng)前也出現(xiàn)高表達（P<0.05）。 結(jié)論： 1.應(yīng)用自制的簡易皮膚器官培養(yǎng)裝置，體外成功建立銀屑病皮損模型。利用加入銀屑病患者自身外周血T淋巴細(xì)胞及人類致病性乙型溶血性鏈球菌抗原的無血清培養(yǎng)基體外培養(yǎng)銀屑病皮損，可維持銀屑病皮損活性及組織學(xué)特征。 2.首次利用無血清培養(yǎng)基體外培養(yǎng)銀屑病皮損，純化了體外器官培養(yǎng)的培養(yǎng)條件，可借鑒用于其他器官培養(yǎng)。 3.利用無菌六孔板以擦鏡紙為承載面，自制簡易皮膚器

7、官培養(yǎng)裝置，提供了皮膚組織氣液界面生長的環(huán)境，制作簡單易行，節(jié)約成本，可應(yīng)用于體外皮膚組織培養(yǎng)。 4.利用免疫組化及生物化學(xué)技術(shù)檢測角蛋白17，從分子學(xué)水平證明銀屑病皮損體外培養(yǎng)的有效維持，證實了角蛋白17在銀屑病皮損中的特異性表達，確立了角蛋白17可作為鑒定銀屑病皮損的檢測指標(biāo)；同時證實了鏈球菌抗原對K17產(chǎn)生的刺激作用，。 5.利用酶聯(lián)接免疫吸附劑檢測不同培養(yǎng)條件下銀屑病皮損和正常皮膚組織均漿中IL-8、INF-γ、

8、TNF-α的含量，從免疫學(xué)角度進一步證實了銀屑病皮損體外培養(yǎng)的有效維持。同時驗證了IL-8、INF-γ、TNF-α在銀屑病皮損中的顯著高表達。通過對比不同培養(yǎng)條件下，各細(xì)胞因子含量比較，證實了鏈球菌不僅是急性銀屑病的誘發(fā)因素，更是銀屑病持續(xù)存在的刺激因素。 6.利用加入銀屑病患者自身外周血T淋巴細(xì)胞及人類致病性乙型溶血性鏈球菌抗原的無血清培養(yǎng)基體外有效維持銀屑病皮損的表型，再次證實了活化的T細(xì)胞及鏈球菌抗原在銀屑病發(fā)病中的核心作