殼聚糖-硝酸鈰銨聚合輔助信號(hào)放大體系的建立及在病變p53基因檢測(cè)中的應(yīng)用研究.pdf

1、分子診斷在疾病早期診斷及治療中發(fā)揮著重要的作用，現(xiàn)有的常用DNA檢測(cè)手段具有檢測(cè)靈敏度高、生物特異性好、檢測(cè)準(zhǔn)確率高的優(yōu)點(diǎn)，但這些技術(shù)亦具有開發(fā)難度高、成本昂貴、操作繁雜、對(duì)高精密儀器依賴性強(qiáng)、對(duì)操作人員科學(xué)素養(yǎng)要求高等限制。而聚合物輔助信號(hào)放大作為一種新型分子診斷技術(shù)，可以原位生成聚合物，其檢測(cè)靈敏度高、無需借助精密儀器、可裸眼檢測(cè)的特點(diǎn)使其成為最近研究的熱點(diǎn)。
　　本文建立了殼聚糖-硝酸鈰銨氧化還原聚合輔助信號(hào)放大(CS-CA

2、N RP)體系，并研究了其在病變p53基因DNA片段檢測(cè)中的應(yīng)用。利用連接于待檢測(cè)物質(zhì)上的還原劑大分子天然物質(zhì)殼聚糖(CS)，與氧化劑硝酸鈰銨(CAN)構(gòu)成氧化還原對(duì)，發(fā)生氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生活性自由基，從而在常溫、常壓、水溶液等極其溫和的條件下引發(fā)單體原位聚合，達(dá)到放大被測(cè)物質(zhì)信號(hào)的目的。最優(yōu)檢測(cè)條件為:反應(yīng)pH為5.0，SA與表面生物素的結(jié)合時(shí)間為至少1h，CS-biotin濃度為1.0 mg/mL，CS-biotin與SA結(jié)合時(shí)間至少

3、為1.5 h，CAN濃度為5-10μmol/mL，Redox聚合時(shí)間為2h。在此基礎(chǔ)上對(duì)模擬分子SA進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)限為0.05 ng/mL。
　　在最優(yōu)檢測(cè)條件下對(duì)DNA檢測(cè)進(jìn)行了研究，研究結(jié)果表明，CS-CAN RP體系對(duì)DNA檢測(cè)最低限度為0.05 nM，具有較高的檢測(cè)靈敏度，而且當(dāng)目標(biāo)DNA濃度在1.0 nM以上時(shí)，檢測(cè)結(jié)果可達(dá)到裸眼分辨的效果。
　　接著利用CS-CAN RP體系對(duì)導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌的病變p53基因D

4、NA序列進(jìn)行了檢測(cè)，該病變類型為p53基因248位密碼子第一個(gè)堿基及249位密碼子第三位堿基的突變，當(dāng)目標(biāo)DNA序列濃度為1μM時(shí)，經(jīng)由CS-CAN RP體系得到的病變序列及正常序列原位點(diǎn)聚合物厚度分別為300 nm及15 nm;當(dāng)病變位點(diǎn)為病變類型為p53基因249位密碼子第三位堿基的突變，目標(biāo)DNA序列濃度為1μM時(shí)時(shí)，經(jīng)由CS-CAN RP體系得到的病變序列及正常序列原位點(diǎn)聚合物厚度分別為300 nm及40 nm。以上結(jié)果表明CS