EGFP示蹤研究擬態(tài)弧菌感染動態(tài)過程及菌影的靶向遞送特性.pdf

1、擬態(tài)弧菌（Vibrio mimicus）是一種嚴重危害水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的病原菌，可引起養(yǎng)殖魚類腹水病。大量研究表明擬態(tài)弧菌可產(chǎn)生黏附素、腸毒素和溶血素等多種毒力因子，但是其感染過程以及宿主主要靶組織尚不清楚。細菌標記技術(shù)是使用標記物標記細菌，以實現(xiàn)對目標細菌的識別，從而達到對其定位及示蹤的目的。對此，本課題使用增強型綠色熒光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)標記擬態(tài)弧菌，通過綠色熒光信號示蹤

2、該菌在感染草魚（Ctenopharyngodon idellus）體內(nèi)的動態(tài)分布，確定其黏附定植與生長繁殖的靶組織，為魚類腹水病的防控提供科學依據(jù)。同時，以pEGFP-N1為模式質(zhì)粒，巨噬細胞系RAW264.7為APC，對大腸桿菌菌影（Bacterial Ghosts,BG）的裝載和靶向遞送質(zhì)粒特性進行驗證，為擬態(tài)弧菌菌影型基因疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。本課題具體開展了以下研究工作：
　　1.擬態(tài)弧菌的EGFP基因標記及其特性分析

3、>　　將EGFP基因克隆至原核表達載體pBAD24構(gòu)建重組表達質(zhì)pBAD24-EGFP，然后電轉(zhuǎn)至擬態(tài)弧菌04-14分離菌株的感受態(tài)細胞，獲得擬態(tài)弧菌標記菌株，并分析其情況表達、生長性、黏附致病性等特性。結(jié)果顯示，該標記菌株經(jīng)L-阿拉伯糖誘導后，SDS-PAGE顯示分子量約為27.0 ku的 EGFP蛋白得到表達；熒光顯微鏡觀察和流式細胞儀檢測均發(fā)現(xiàn)該標記菌株能夠發(fā)出明顯的綠色熒光信號。與野生菌株相比，標記菌株的形態(tài)特征、生長特性、細胞

4、黏附性以及致病性幾乎未發(fā)生改變，且具有遺傳穩(wěn)定性，表明擬態(tài)弧菌標記菌株可用于后續(xù)的感染示蹤研究。
　　2.擬態(tài)弧菌在感染草魚體內(nèi)的動態(tài)分布
　　用濃度為5×107 CFU/mL的擬態(tài)弧菌標記菌株的菌液浸泡感染草魚5 h。爾后，將感染后草魚轉(zhuǎn)入飼養(yǎng)水體進行喂養(yǎng)。分別于感染后4、6、8、10、12、24、48、72和85 h，隨機剖殺實驗組及對照組草魚各3尾，無菌采集鰓、肝、脾、頭腎、腸和肌肉組織并稱重，其中一半重量的組織樣品置

5、熒光顯微鏡下觀察是否發(fā)熒光；另一半重量的組織樣品用于檢測載菌量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染后4h即可在腸道和鰓中檢測到綠色熒光信號，標記菌株檢出量分別為3.60×108 CFU/g和2.36×106 CFU/g，至10h含量無明顯變化，12h后含菌量逐漸下降，但直至魚死亡腸道比其他臟器均呈現(xiàn)較高的帶菌量。感染24h后在頭腎、肌肉、肝臟和脾臟中才檢測到熒光信號，且載菌量先增加后下降，48h達到峰值，檢出量分別為8.75×104CFU/g、9.58×10

6、4CFU/g、4.50×104CFU/g和1.50×104CFU/g，均低于腸道中的檢出量。結(jié)果表明擬態(tài)弧菌是一種腸道病原菌，腸黏膜組織是其黏附定植和生長繁殖的靶組織。
　　3.大腸桿菌菌影的裝載與靶向遞送質(zhì)粒特性的驗證
　　將攜帶溫控裂解質(zhì)粒pBV220-E的重組大腸桿菌DH5α菌株于28℃培養(yǎng)至對數(shù)期，這時迅速將培養(yǎng)溫度升至42℃，以誘導裂解基因E表達，裂解細菌，制備菌影（BG）。掃描電鏡和透射電鏡觀察到BG保持細菌原有

7、的形態(tài)與膜結(jié)構(gòu)，但是細胞表面出現(xiàn)明顯的跨膜溶菌孔道，內(nèi)部基本不含內(nèi)容物。將BG與質(zhì)粒pEGFP-N1按不同濃度比例共同孵育后加入膜囊封閉過夜，置于流式細胞儀檢測裝載效率。隨后，在最佳裝載條件下，將載有pEGFP-N1的BG轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細胞系RAW264.7，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察和流式細胞儀檢測吞噬效率和蛋白表達情況。結(jié)果顯示BG和質(zhì)粒pEGFP-N1濃度比為5:2時，裝載效率、吞噬效率和蛋白表達率分別為90.13％、98.47%和4