鉤藤堿抗苯丙胺依賴作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：苯丙胺類中樞興奮劑流行性濫用造成了嚴(yán)重的社會(huì)危害，對(duì)其干預(yù)是防治藥物依賴的一個(gè)新課題。對(duì)苯丙胺依賴形成機(jī)制研究有待進(jìn)一步深入。中藥鉤藤已在許多戒毒復(fù)方中使用，但其主要活性成分鉤藤堿對(duì)苯丙胺類依賴的影響及作用機(jī)制尚未明確。 目的：復(fù)制苯丙胺依賴大鼠模型，觀察鉤藤堿對(duì)苯丙胺依賴大鼠條件性位置偏愛(ài)效應(yīng)的影響，檢測(cè)大鼠腦內(nèi)伏核及杏仁核NMDA受體2B亞單位的表達(dá)及中樞氨基酸類、單胺類及內(nèi)啡肽類神經(jīng)遞質(zhì)含量的變化，探討苯丙胺依賴形成

2、的神經(jīng)機(jī)制及鉤藤堿抗苯丙胺依賴的作用機(jī)理。 設(shè)計(jì)：完全隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)研究。 動(dòng)物：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用雄性SD大鼠，經(jīng)自然位置偏愛(ài)時(shí)間測(cè)定合格動(dòng)物共96只，體重(200-260)g，由第一軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為空白對(duì)照組、苯丙胺模型組、陽(yáng)性藥氯胺酮組、鉤藤堿系列劑量組及鉤藤堿+生理鹽水組。 方法：鉤藤堿對(duì)苯丙胺依賴大鼠條件性位置偏愛(ài)效應(yīng)的影響及大鼠腦內(nèi)伏核和杏仁核NMDA受體2B亞單位表達(dá)的實(shí)驗(yàn)共分7個(gè)組：即(

3、1)空白對(duì)照組，(2)苯丙胺模型組，(3)氯胺酮(15mg/kg)+苯丙胺組，(4)鉤藤堿低劑量(10mg/kg)+苯丙胺組，(5)鉤藤堿中劑量(20mg/kg)+苯丙胺組，(6)鉤藤堿高劑量(60mg/kg)+苯丙胺組，(7)鉤藤堿(60mg/kg)+生理鹽水組，每組8只大鼠。經(jīng)基線測(cè)定合格后隨機(jī)分組。動(dòng)物給藥方法如下：(2)-(6)組每天上午(8：00)給予苯丙胺(2mg/kg，sc)，連續(xù)給藥4d；(3)組從第3天起在給苯丙胺之前

4、15min，ip給予氯胺酮(15mg/kg)，連續(xù)3d；(4)-(6)組于第二天20：00(即給苯丙胺后12h)，分別按上述劑量ip給予鉤藤堿，連續(xù)3d；(1)組以同容量生理鹽水替代苯丙胺給藥，其他處理同(2)組；(7)組每天上午(8：00)ip給予鉤藤堿(60mg/kg)。各組大鼠下午(16：00)均給予生理鹽水(0.5ml，sc)一次，間隔8h。連續(xù)4d。各組動(dòng)物第1天上午注射藥物后立即將其置于伴藥箱即白箱，下午注射生理鹽水后立即將

5、其置于偏愛(ài)側(cè)黑箱，搭配時(shí)間均為1h，共訓(xùn)練4d。在末次給予苯丙胺24h后進(jìn)行位置偏愛(ài)檢測(cè)，記錄大鼠在白箱中停留的時(shí)間。位置偏愛(ài)測(cè)定結(jié)束后，用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，用4％多聚甲醛灌注固定，取出腦組織，脫水、石蠟包埋。對(duì)照大鼠腦解剖圖譜，分別選取含伏核、杏仁核部位的切片。嚴(yán)格按照博士德即用型SABC免疫組化染色試劑盒說(shuō)明書(shū)及博士德NMDA-2B原位雜交檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，免疫組化和原位雜交每組均設(shè)陰性對(duì)照。封片后顯微鏡下觀察，選取含伏核及杏

6、仁核部位分別照相，并選取相同大小視野下進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。腦電超慢漲落分析儀檢測(cè)大鼠腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)方法為：復(fù)制苯丙胺依賴大鼠模型，共分5個(gè)組，其中鉤藤堿只設(shè)60mg/kg劑量組，給藥方法同前。進(jìn)行位置偏愛(ài)測(cè)定后采用腦電超慢漲落分析儀，記錄大鼠處于安靜狀態(tài)下的腦電信號(hào)并進(jìn)行腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)信息處理，每只大鼠檢測(cè)18min。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS(10.0)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的單因素方差分析和t檢驗(yàn)。 主要觀察指標(biāo)：苯丙胺依賴

7、大鼠條件性位置偏愛(ài)測(cè)定實(shí)驗(yàn)中記錄大鼠15min內(nèi)在白箱的停留時(shí)間。采用免疫組化和原位雜交技術(shù)檢測(cè)大鼠腦內(nèi)伏核及杏仁核NR2B陽(yáng)性細(xì)胞形態(tài)、分布及其數(shù)密度以及NR2BmRNA的表達(dá)。使用腦電超慢漲落分析儀觀察大鼠全腦分維參數(shù)地形圖和腦內(nèi)氨基酸類、單胺類及內(nèi)啡肽類神經(jīng)遞質(zhì)含量的變化。 結(jié)果：連續(xù)給予苯丙胺(2mg/kg)4d，大鼠在伴藥箱的逗留時(shí)間與空白對(duì)照組比較明顯延長(zhǎng)(P＜0.01)，表明大鼠產(chǎn)生顯著的條件性位置偏愛(ài)效應(yīng)，建立了

8、苯丙胺依賴動(dòng)物模型。鉤藤堿中、高劑量組大鼠在伴藥箱的逗留時(shí)間與空白對(duì)照組比較均無(wú)明顯差異，低劑量組稍有延長(zhǎng)(P＜0.05)，與模型組比較均明顯縮短(P＜0.01)，鉤藤堿各劑量組隨劑量的增加其作用相應(yīng)增強(qiáng)。鉤藤堿+生理鹽水組大鼠在伴藥箱的逗留時(shí)間與空白對(duì)照組比較無(wú)明顯差異，與模型組比較有明顯差異(P＜0.01)，即不形成條件性位置偏愛(ài)。免疫組化和原位雜交檢測(cè)結(jié)果表明，正常大鼠腦內(nèi)伏核及杏仁核NR2B、NR2BmRNA主要分布于胞膜及胞漿

9、，經(jīng)DAB顯色后呈棕黃色。苯丙胺模型組大鼠伏核及杏仁核NR2B、NR2BmRNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)密度與空白對(duì)照組、氯胺酮組、鉤藤堿低、中、高三個(gè)劑量組及鉤藤堿+生理鹽水組比較均明顯增加(P＜0.01)，且胞核亦有著色。氯胺酮組、鉤藤堿中、高劑量組及鉤藤堿+生理鹽水組大鼠腦內(nèi)伏核及杏仁核NR2B、NR2BmRNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與空白對(duì)照組比較均無(wú)顯著性差異，鉤藤堿低劑量組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較空白對(duì)照組增加(P＜0.01)。免疫組化伏核及杏仁核NR2B缺一

10、抗及二抗陰性對(duì)照均未見(jiàn)胞膜、胞漿著色，原位雜交NR2BmRNA缺寡核苷酸探針陰性對(duì)照和缺生物素化抗寡核苷酸探針陰性對(duì)照也均未見(jiàn)NR2BmRNA著色。用腦電超慢漲落分析儀檢測(cè)大鼠全腦分維參數(shù)地形圖時(shí)發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組大鼠全腦分維參數(shù)地形圖表現(xiàn)為“腦功能平衡圖”，苯丙胺模型組大鼠則完全偏離“腦功能平衡圖”，氯胺酮組、鉤藤堿組及鉤藤堿+生理鹽水組大鼠則與空白對(duì)照組相似。苯丙胺模型組大鼠腦內(nèi)IAAs、ACh及內(nèi)啡肽含量與空白對(duì)照組、氯胺酮組、鉤藤

11、堿組及鉤藤堿+生理鹽水組比較均顯著降低(P＜0.01)，EAAs、DA及NE含量則顯著升高(P＜0.01)；氯胺酮組、鉤藤堿組及鉤藤堿+生理鹽水組大鼠腦內(nèi)IAAs、EAAs、ACh、DA、NE及內(nèi)啡肽含量與空白對(duì)照組比較均無(wú)顯著性差異。 各組大鼠腦內(nèi)5-HT含量相互比較均無(wú)顯著性差異。 結(jié)論：預(yù)先給予鉤藤堿能在一定程度上消除苯丙胺誘導(dǎo)的條件性位置偏愛(ài)效應(yīng)，氯胺酮也能基本消除苯丙胺引起的位置偏愛(ài)效應(yīng)，而鉤藤堿本身未顯示精神

12、依賴性潛力。苯丙胺能增加大鼠腦內(nèi)伏核及杏仁核NR2B表達(dá)，這可能與苯丙胺依賴大鼠條件性位置偏愛(ài)形成有內(nèi)在聯(lián)系。鉤藤堿中、高劑量及氯胺酮對(duì)苯丙胺誘導(dǎo)伏核及杏仁核NR2B表達(dá)上調(diào)有抑制作用，鉤藤堿低劑量作用不明顯。鉤藤堿三個(gè)劑量及氯胺酮對(duì)伏核及杏仁核NR2B表達(dá)的抑制作用與對(duì)苯丙胺誘導(dǎo)大鼠位置偏愛(ài)效應(yīng)的抑制作用基本一致。鉤藤堿對(duì)正常大鼠腦內(nèi)NR2B表達(dá)無(wú)明顯影響與鉤藤堿不能誘導(dǎo)條件性位置偏愛(ài)形成相一致。苯丙胺依賴改變了正常大鼠腦功能的平衡狀