DHBV分子流行病學(xué)調(diào)查及雛鴨人工感染DHBV疾病模型的建立與初步應(yīng)用.pdf

1、959。12r：J’。：一分類號(hào)一世12墅：一四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩：士一i。學(xué)一一位論文、～、，’一DHBV分子流行病學(xué)調(diào)查及雛鴨人工感染、、一一一，、^～一、一一一。～?！痡’‘DHBV一：疾病模型的建立與初步應(yīng)用’，一‘一一指導(dǎo)教師，，一一j徐大為一’|‘。學(xué)科專業(yè)：囂隨羞醫(yī)堂一諺l『究方舟。，，。麴簟蘊(yùn)睪堂，哼2006年6月摘要本研究根據(jù)GenBank中登錄的鴨乙型肝炎病毒(DuckhepatitisBvirus，DHBV)的全基因序列

2、，建立了常規(guī)PCR和熒光定量PCR兩種檢測(cè)DHBV方法，分別用于DHBV分子流行病學(xué)調(diào)查和人工感染DHBV疾病模型的建立。并利用建立的疾病模型篩選和評(píng)估抗乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus，HBV)新藥物的研究。針對(duì)DHBV的保守序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物，建立了PCR檢測(cè)方法，采用該方法檢測(cè)含DHBV樣品能夠擴(kuò)增出215bp預(yù)期大小的片段。該方法對(duì)鴨病毒性肝炎病毒、鴨瘟病毒、鴨源致病性大腸埃希氏菌、鴨源致病性沙門氏菌、鴨疫里默氏桿菌等

3、感染鴨的常見(jiàn)病原都呈陰性反應(yīng)；檢測(cè)DHBV核酸的靈敏度可達(dá)042pg，對(duì)天府肉鴨血清檢測(cè)的陽(yáng)性率為1234％(38／326)。該法特異強(qiáng)、靈敏性高，可用于DHBV的快速診斷和分子流行病學(xué)調(diào)查。針對(duì)DHBV的P基因上的保守序列設(shè)計(jì)并合成引物和熒光標(biāo)記探針，建立了實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(fluorsescencequantitativepolymerasechainreaction，F(xiàn)QPCR)檢測(cè)方法。建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線循環(huán)閾值(cycle

4、threshold，Ct值)與模板濃度具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0996，最低可檢N5copies／L的DHBV—DNA，即相當(dāng)于5個(gè)DHBV顆粒。該方法較常規(guī)PCR技術(shù)更為簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，靈敏度高100倍。用不同劑量的DHBV陽(yáng)性血清經(jīng)不同感染途徑人工感染1日齡天府肉鴨(DHBV為陰性)，于感染后2d、4d、6d、8d、10d、12d、14d、16d、19d、22d、26d、31d、37d、44d、52d、60d、70d分別殺鴨

5、無(wú)菌取血和肝組織，用所建立的FQ—PCR方法檢測(cè)肝臟和外周血中DHBV—DNA的含量。結(jié)果感染后48h可從外周血和肝組織中檢測(cè)出DHBVDNA，N70天仍可檢測(cè)出較高水平的DHBV—DNA：肝組織中DHBV—DNA含量的整體水平比外周血中高，維持時(shí)間也較長(zhǎng)。外周血和肝組織中的DHBVDNA水平與感染劑量呈正相關(guān)，并表現(xiàn)出一定的劑量依賴性。天府肉鴨對(duì)DHBV敏感，用DHBV陽(yáng)性血清感染1日齡天府肉鴨可建立DHBV疾病感染模型。用天府肉鴨D