Paxillin在HPS相關PASMCs異常增殖中的作用和機制研究.pdf

1、背景和目的:
　　肝肺綜合征(hepatopulmonary syndrome,HPS)主要發(fā)生在包括肝硬化在內的終末期肝病患者中,其發(fā)生率超過15％,而死亡率逐年增加,因此對于HPS的研究逐漸成為一個熱點。肝源性細胞因子,導致肺內微血管擴張(intraplmonary vasodilatation,IPVD),最終導致PASMCs的異常增殖,進一步加重肺血管重建(pulmonary vascular remodelling,PV

2、R)。因此,PASMCs的異常增殖是HPS相關PVR最主要的病理變化。我們前期的研究發(fā)現(xiàn),HPS大鼠血清及3%濃度氧氣等可以誘導PASMCs異常增殖;同時,PASMCs發(fā)生表型轉化及其骨架蛋白也發(fā)生表達變化。既往研究發(fā)現(xiàn),在一些疾病(如肺動脈高壓)的病理進程中,PASMCs異常增殖的同時,伴隨著PASMCs的表型轉化和骨架重排;PASMCs的表型轉化及其骨架蛋白的表達變化是PASMCs發(fā)生異常增殖的上游途徑。尋找骨架蛋白變化和細胞增殖的

3、關系,有利于進一步解釋HPS的分子機制。
　　樁蛋白(Paxillin)是一種磷酸化蛋白,既往研究發(fā)現(xiàn),其在多種細胞內表達,參與多種細胞的生物學功能調節(jié),在細胞骨架蛋白的表達與重排中起重要調控作用。既往研究發(fā)現(xiàn),膜聯(lián)蛋白A1(annexin A1,ANXA1)可能和Paxillin具有相互作用,其可能影響Paxillin的表達,對Paxillin的研究是在前期研究上的深入,具有重要意義。基于上述依據(jù),我們推測:在HPS相關的PAS

4、MCs異常增殖中,首先出現(xiàn)細胞骨架蛋白的表達變化和骨架重排以及細胞表型轉化,進而導致PASMCs的異常增殖;Paxillin可能在細胞骨架蛋白的表達調節(jié)中起重要作用,并最終影響PASMCs的增殖。本研究擬通過膽總管結扎(common bile duct ligation,CBDL)構建HPS大鼠模型,原代培養(yǎng)PASMCs,利用CCK-8、3H-TdR、RT-PCR及Western-blot等方法檢測PASMCs的增殖情況和其中Paxil

5、lin及骨架蛋白的表達情況;通過siRNA干擾技術對Paxillin進行干預,探討其中的分子機制;最終揭示Paxillin在HPS相關PASMCs異常增殖中的分子機制,為HPS的預防和診治提供更好的措施。
　　方法:
　　實驗分為兩部分:
　　(1)HPS大鼠血清培養(yǎng)的PASMCs中Paxillin及骨架蛋白表達的變化
　　1)構建HPS大鼠模型及血清制備
　　2)大鼠PASMCs的分離、培養(yǎng)和鑒定

6、　　3)RT-PCR及Western-blot法檢測Paxillin的表達變化
　　4)Western-blot法檢測骨架蛋白(α-actin,α-tubulin,destrin)的表達變化
　　(2)下調Paxillin的表達對HPS大鼠血清培養(yǎng)的PASMCs中骨架蛋白表達及其增殖的影響
　　1)siRNA下調PASMCs中Paxillin的表達
　　2)下調Paxillin表達后對HPS血清培養(yǎng)的PASMCs

7、異常增殖及骨架蛋白表達的影響
　　結果:
　　(1)HPS大鼠血清可以誘導Paxillin的轉錄和蛋白表達水平明顯上調,這一上調呈時間相關性。
　　(2)HPS大鼠血清刺激下PASMCs中骨架蛋白(α-actin,destrin,α-tubulin)表達呈時間相關性下調。
　　(3)利用特異性的Paxillin siRNA可以有效抑制Paxillin的蛋白表達。
　　(4)抑制Paxillin的表達后,HP