黃疸患者血清調節(jié)人PASMCs增殖及表型轉換作用的研究.pdf

1、肝肺綜合征(hepatopulmonary syndrome,HPS)是一種因肝臟受損引起遠端器官肺發(fā)生嚴重病理改變的疾病,以“慢性肝病-肺微血管擴張和增生-低氧血癥”為主要特征。在此病理過程中,慢性肝病產(chǎn)生大量的刺激因子(如細胞因子、生長因子、趨化因子等),通過血液循環(huán)到達肺臟,作用于肺微血管內(nèi)皮細胞(pulmonary microvascular endothelial cells,PMVECs),導致肺內(nèi)微血管擴張和增生,使肺部發(fā)

2、生氧合障礙出現(xiàn)低氧血癥。
　　目前,HPS的發(fā)病機制尚不明確。動物實驗研究發(fā)現(xiàn)大鼠膽總管結扎(common bile duct ligation, CBDL)后肺動脈管壁增厚導致了阻塞性肺血管病變,我們的前期研究發(fā)現(xiàn)CBDL大鼠血清可以促進肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells, PASMCs)發(fā)生表型轉換和增殖。此外,大量研究表明PASMCs表型轉換和增殖是低氧性肺血管重建的核

3、心變化。這些結果提示低氧環(huán)境可能促進HPS大鼠PASMCs發(fā)生表型轉換和增殖,導致肺動脈管壁增厚,從而加重了肺部低氧血癥,促進了HPS的發(fā)生發(fā)展。但是,在HPS患者中是否也發(fā)生PASMCs表型轉換和增殖,尚不清楚,值得進一步研究。而黃疸多見于慢性肝病患者,鑒于此,我們推測:慢性肝病產(chǎn)生大量細胞因子、趨化因子及生長因子釋放入血,通過血液循環(huán)達到肺臟,作用于PASMCs引起了肺血管的病理性重建,導致了HPS的發(fā)生發(fā)展,這就是本課題立題的目的

4、。本課題通過原代培養(yǎng)成人PASMCs,觀察黃疸患者血清調節(jié)人PASMCs增殖及表型轉換的變化,同時,檢測肝硬化患者血清中細胞因子的變化情況,篩選出起關鍵作用的細胞因子,從而為HPS的防治提供新的靶點。
　　研究內(nèi)容:
　　1.應用含適量的PDGF的高糖培養(yǎng)基原代培養(yǎng)成人PASMCs,運用光鏡、免疫熒光染色法進行鑒定。
　　2.黃疸患者血清的收集,分別用正常和黃疸血清刺激人 PASMCs,用 CCK-8分別檢測其增殖情況

5、,Western blot檢測其calponin和α-SM-actin蛋白的變化情況。
　　3.應用luminex-XMAP液相芯片檢測肝硬化患者血清中61種細胞因子的變化情況
　　研究結果:
　　1.應用改良的成人 PASMCs培養(yǎng)方法進行原代培養(yǎng),細胞在光鏡下呈梭形,細胞之間突起相互接觸,可見典型的“峰-谷”征象,細胞內(nèi)calponin和α-SM-actin蛋白經(jīng)免疫熒光染色鑒定均為陽性,說明了人PASMCs培養(yǎng)成

6、功。
　　2.黃疸患者血清促進人 PASMCs的增殖。與正常血清刺激人 PASMCs比較,黃疸血清刺激人PASMCs的體外增殖能力明顯增強。在不同時間段內(nèi),48h內(nèi)的增殖能力最強,雖然48h到72h增殖能力較弱,但仍比24h內(nèi)增殖能力強。說明了黃疸患者血清可以促進人PASMCs在體外增殖。
　　3.黃疸患者血清促進人PASMCs發(fā)生表型轉換作用24h后,western bolt檢測結果發(fā)現(xiàn),與正常血清相比,黃疸血清刺激α-S

7、M-actin蛋白變化不明顯,而calponin蛋白卻表達升高。但是,隨著作用時間延長,48h和72h后,黃疸血清刺激α-SM-actin和calpnion蛋白的表達均明顯減少。
　　4.luminex-XMAP液相芯片檢測結果顯示61種細胞因子中,IL-6,IL-8,IL-15, IL-16,IL-23,TNF-α,IL-28A,LIF,I-309,IP10,MCP-4,6Ckine,BCA-1,MIP-1δ, INF-γ表達明

8、顯升高,而其他的細胞因子(如 IL-3、IL-7、TRAC、TRAIL、GRO、MCP-1、MCP-2、ENA-78及sCD40L)表達明顯下降。
　　結論:
　　1.改良的成人PASMCs培養(yǎng)方法克服了成人肺動脈平滑肌細胞培養(yǎng)困難的問題,同時將人PASMCs應用于實驗更符合人體形態(tài)學及生物學特征。
　　2.黃疸患者血清促進人PASMCs體外發(fā)生表型轉換和增殖。
　　3.通過luminex- XMAP液相芯片技術