ZAG與FASN交互作用在調(diào)節(jié)腸癌惡性表型中的作用及其機(jī)制.pdf

1、背景與目的：
　　腫瘤惡性生物學(xué)行為與其特殊的物質(zhì)能量代謝密切相關(guān)，異常的物質(zhì)能量代謝已成為腫瘤細(xì)胞新的生物學(xué)特性并越來越受到關(guān)注。鋅-α2-糖蛋白(Zinc-α2-glycoprotein，ZAG)基因定位于染色體7q22.1，其編碼42kDa的分泌性蛋白，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)ZAG能強(qiáng)烈促進(jìn)脂肪分解，多種腫瘤中ZAG表達(dá)常下調(diào)，而脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase，F(xiàn)ASN)與哺乳動(dòng)物雷帕霉素(Mammalian t

2、arget of rapamycin，mTOR)信號(hào)通路活性常上調(diào)，另有報(bào)道稱FASN、Akt/mTOR信號(hào)通路參與多種腫瘤細(xì)胞的物質(zhì)能量代謝，但三者在腸癌細(xì)胞物質(zhì)能量代謝過程中的相互作用機(jī)理并不清楚。本研究旨在探討ZAG與FASN交互作用對(duì)腸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響及其作用機(jī)制。以期進(jìn)一步明確相關(guān)分子在大腸癌發(fā)病過程中的作用，為大腸癌的分子診斷和靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1.RT-PCR與Western b

3、lot檢測(cè)腸癌細(xì)胞系LoVo/HT-29/Caco-2/HCT-116中ZAG基因及蛋白的表達(dá)，選取ZAG表達(dá)低的細(xì)胞株作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的靶細(xì)胞。
　　2.構(gòu)建ZAG過表達(dá)質(zhì)粒及其空載質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞株，觀察轉(zhuǎn)染效率，RT-PCR與Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后ZAG基因及蛋白表達(dá)。
　　3.RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后LoVo細(xì)胞FASN、mTOR、Akt等相關(guān)信號(hào)通路基因的表達(dá);Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后LoVo細(xì)

4、胞FASN、t-mTOR、p-mTORser2448、t-Akt、p-Aktser473等相關(guān)信號(hào)通路蛋白的表達(dá)。
　　4.檢測(cè)過表達(dá)ZAG質(zhì)粒及其空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞后ATP水平的變化，并檢測(cè)各組細(xì)胞上清中乳酸水平改變，研究ZAG對(duì)腸癌細(xì)胞能量代謝的影響。
　　5.MTT增殖實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)以及Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ZAG過表達(dá)對(duì)腸癌細(xì)胞株增殖、侵襲和遷移能力的影響，使用碘化丙啶(Propidium iodide，PI

5、)標(biāo)記各組靶細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染ZAG前后靶細(xì)胞細(xì)胞周期的變化。
　　6.不同濃度(0.001μM，0.01μM，0.1μM，1μM，10μM)的FANS特異性淺藍(lán)菌素(Cerulenin)作用于腸癌細(xì)胞HT-29和LoVo細(xì)胞株，藥物毒性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)淺藍(lán)菌素對(duì)腸癌細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(Inhibitory concentration of50％，IC50)。
　　7.QRT-PCR和Western blot檢測(cè)Cerulen

6、in處理組、DMSO對(duì)照組和空白組細(xì)胞中ZAG、FASN、t-mTOR、p-mTORser2448、t-Akt、p-Aktser473等相關(guān)分子的表達(dá)。
　　8.使用Cerulenin處理HT-29和LoVo細(xì)胞，檢測(cè)處理組和對(duì)照組細(xì)胞中ATP水平及培養(yǎng)基中乳酸變化，觀察Cerulenin對(duì)各組腸癌細(xì)胞能量代謝的影響。
　　9.細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)、Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Cerulenin對(duì)各組腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能

7、力的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Cerulenin對(duì)LoVo和HT-29細(xì)胞細(xì)胞凋亡的影響。
　　結(jié)果：
　　1.RT-PCR結(jié)果顯示，與HT-29/Caco-2/HCT-116腸癌細(xì)胞相比，LoVo細(xì)胞中ZAG基因相對(duì)表達(dá)最低（0.46±0.05）(P＜0.05），Western blot檢測(cè)4株腸癌細(xì)胞中ZAG蛋白的表達(dá)，結(jié)果提示LoVo細(xì)胞中ZAG蛋白相對(duì)表達(dá)（0.43±0.05）最低(P＜0.05），因此本章實(shí)驗(yàn)選取LoVo

8、細(xì)胞作為靶細(xì)胞。
　　2.使用pGCMV/EGFP/Neo/ZAG質(zhì)粒及其空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LoVo細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察綠色熒光表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)組與空載質(zhì)粒組均有較高的轉(zhuǎn)染效率，使用抗性基因成功篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，RT-PCR證實(shí)轉(zhuǎn)染pGCMV/EGFP/Neo/ZAG質(zhì)粒后的LoVo細(xì)胞ZAG基因相對(duì)表達(dá)增加（0.65±0.05）（P＜0.05），Western blot顯示與其它對(duì)照組相比實(shí)驗(yàn)組ZAG蛋白相對(duì)表達(dá)增加（0.67±0.0

9、6）(P＜0.05）?？蛰d質(zhì)粒組和空白組ZAG表達(dá)無差異(P＞0.05)。
　　3.RT-PCR結(jié)果顯示;與空載質(zhì)粒組和空白組相比，轉(zhuǎn)染ZAG質(zhì)粒的LoVo細(xì)胞中FASN基因相對(duì)表達(dá)(0.55±0.08)下調(diào)(P＜0.05），但mTOR基因(0.81±0.06)與Akt基因(0.78±0.06)相對(duì)表達(dá)與對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;Western blot結(jié)果顯示，與空載質(zhì)粒組和空白組相比，轉(zhuǎn)染過表達(dá)ZAG質(zhì)粒的LoVo細(xì)胞FASN(

10、0.61±0.06)、p-mTORser2448(0.53±0.08)和p-Ak tser473(0.58±0.10)相對(duì)表達(dá)下調(diào)(P＜0.05），t-mTOR(0.97±0.13)和t-Akt(0.83±0.14)相對(duì)表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　4.與空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和空白組相比，轉(zhuǎn)染過表達(dá)ZAG質(zhì)粒的LoVo細(xì)胞內(nèi)ATP含量(611.23±97.37mmol/grot)降低，細(xì)胞上清中乳酸的濃度（29.84±5.04

11、mmol/L）也同時(shí)降低(P＜0.05）。
　　5.MTT實(shí)驗(yàn)顯示與空載質(zhì)粒組和空白組相比，過表達(dá)ZAG的LoVo細(xì)胞的增殖能力（0.79±0.08）減弱;克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組LoVo細(xì)胞細(xì)胞克隆形成率降低（4.38％±0.71％）;Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示轉(zhuǎn)染ZAG過表達(dá)質(zhì)粒的LoVo細(xì)胞穿過半透膜的數(shù)量（64.33±8.02）明顯減少;使用PI標(biāo)記各組細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示實(shí)驗(yàn)組LoVo細(xì)胞G2期的細(xì)胞比例（

12、29.47％±2.03％）增高(P＜0.05）。
　　6.使用一系列Cerulenin濃度處理HT29和LoVo細(xì)胞48h后，二者增殖率分別是(82.34±5.38％，74.78±9.44％，66.21±4.37％，60.16±9.95％，38.05±8.26％)和(83.45±7.86％，75.05±9.11％，63.93±4.48％，45.59±11.42％，21.68±6.87％)，Cerulenin處理HT29和LoVo細(xì)

13、胞的IC50分別是1.93μM和0.37μM，使用此Cerulenin濃度和配對(duì)的DMSO濃度進(jìn)行本部分后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　7.RT-PCR結(jié)果顯示，經(jīng)Cerulenin處理后的HT-29和LoVo細(xì)胞株ZAG基因(0.37±0.06和0.29±0.06)表達(dá)水平較空白組和DMSO組降低(P＜0.05)，mTOR基因(0.76±0.14和0.85±0.10)和Akt基因(0.64±0.06和0.78±0.08)相對(duì)表達(dá)與DMSO組和空

14、白組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;Western blot結(jié)果顯示，與空白組和DMSO組相比，經(jīng)Cerulenin處理的HT-29和LoVo細(xì)胞株FASN表達(dá)（0.34±0.08和0.52±0.04）、ZAG(0.38±0.05和0.21±0.04)、p-mTORser2448(0.42±0.03和0.44±0.01)和p-Aktser473(0.55±0.10和0.58±0.10)相對(duì)表達(dá)降低(P＜0.05），但t-mTOR(0.90±0.10和

15、0.88±0.10)和t-Akt相對(duì)表達(dá)(0.80±0.16和0.85±0.11)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05）。
　　8.實(shí)驗(yàn)組HT29和LoVo細(xì)胞中ATP的含量（449.60±94.81mmol/grot和528.73±37.43mmol/grot）較DMSO組和空白組降低(P＜0.05），同時(shí)培養(yǎng)基中的乳酸水平（24.20±3.05mmol/L和29.78±2.10mmol/L）也較DMSO組和空白組降低(P＜0.05），D

16、MSO組與空白組未見ATP或乳酸差異。
　　9.實(shí)驗(yàn)組HT29和LoVo細(xì)胞克隆形成率降低（6.36％±1.07％和11.16％±1.46）（P＜0.05）;同時(shí)FANS的抑制也誘導(dǎo)了HT29和LoVo細(xì)胞侵襲能力（80.33±12.40和96.67±16.27）的降低(P＜0.05);Cerulenin誘導(dǎo)HT29和LoVo細(xì)胞凋亡率（37.41％±8.48％和31.28％±3.98％）增加。
　　結(jié)論：
　　1.Z

17、AG過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建并成功轉(zhuǎn)染入LoVo細(xì)胞，過表達(dá)ZAG可抑制Akt/mTOR通路活性，進(jìn)而抑制FASN的表達(dá)，最終阻滯腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為（細(xì)胞增殖、侵襲能力、凋亡和細(xì)胞周期）及能量代謝。
　　2.FASN的抑制導(dǎo)致Akt/mTOR通路活性降低，進(jìn)一步影響ZAG的表達(dá)，最終阻滯腸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為（細(xì)胞增殖、侵襲能力、凋亡和細(xì)胞周期）及能量代謝。
　　3.ZAG與FASN交互作用可調(diào)節(jié)腸癌細(xì)胞的能量代謝及其惡行性，且此