Wnt-β-catenin信號(hào)途徑和核心巖藻糖基化的交互作用在HEK293T細(xì)胞中的作用機(jī)制研究.pdf

1、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶8(Fucosyltransferases8，F(xiàn)UT8)又稱為核心巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，識(shí)別N-糖鏈與天冬酰胺相連的核心GlcNAc，將巖藻糖基從供體GDP-Fucose轉(zhuǎn)移至此位置，形成α1，6糖苷鍵。巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶家族共有13個(gè)成員，而FUT8地位特殊，它識(shí)別位點(diǎn)單一，且沒(méi)有功能冗余，對(duì)其進(jìn)行研究具有重要意義。FUT8通過(guò)對(duì)靶蛋白的N-糖鏈進(jìn)行修飾而影響其結(jié)構(gòu)和功能，從而參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路、細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、細(xì)胞間粘附、免

2、疫應(yīng)答等過(guò)程。已有研究表明，F(xiàn)UT8在神經(jīng)突觸形成、老化等生理過(guò)程發(fā)揮重要作用;在肝癌、結(jié)腸癌、肺癌、慢阻肺、卵巢癌、腎纖維化、胃癌、胰腺癌、神經(jīng)分裂等多種疾病中出現(xiàn)表達(dá)和活性異常，其靶蛋白AFP已經(jīng)作為分子標(biāo)志物，應(yīng)用于肝癌臨床診斷。
　　Wnt信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、分化、維持成體干細(xì)胞自我更新等生理過(guò)程發(fā)揮著重要作用，同時(shí)在肝癌、肺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、毛囊癌等多種疾病中表出現(xiàn)過(guò)度激活。在目前已知的三條Wnt信號(hào)通路傳導(dǎo)途徑中，經(jīng)

3、典Wnt/β-catenin信號(hào)途徑的研究最為透徹，本文在此基礎(chǔ)上作進(jìn)行研究。
　　在肝癌、肺癌、結(jié)腸癌等多種疾病中，大量病例同時(shí)出現(xiàn)Wnt/β-catenin信號(hào)途徑過(guò)度激活和FUT8表達(dá)異常，而此二者之間是否存在協(xié)同關(guān)系尚未明確。本實(shí)驗(yàn)利用HEK293T細(xì)胞，其Wnt信號(hào)通路處于正常狀態(tài)，F(xiàn)UT8表達(dá)及活性處于正常水平;通過(guò)過(guò)表達(dá)相關(guān)蛋白，觀察該信號(hào)通路和FUT8及核心巖藻糖基化的交互作用，并對(duì)其分子機(jī)制進(jìn)行初步探索。

4、　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1)在HEK293T細(xì)胞中，通過(guò)過(guò)表達(dá)β-catenin、Wnt3a蛋白來(lái)激活Wnt信號(hào)通路，利用Western-blot和HPLC檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)FUT8蛋白表達(dá)水平和催化活性;
　　2)通過(guò)轉(zhuǎn)染FUT8過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及其空載體，利用Western-blot、熒光素酶報(bào)告基因、細(xì)胞免疫熒光化學(xué)等實(shí)驗(yàn)，觀察FUT8對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)途徑的激活作用;利用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察FUT8對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響;

5、
　　3)利用蛋白合成抑制劑Cycloheximide和蛋白酶體抑制劑MG132，觀察FUT8對(duì)β-catenin蛋白穩(wěn)定性和細(xì)胞內(nèi)整體泛素化水平的影響;利用免疫共沉淀、Lectin-blot、Western-blot等實(shí)驗(yàn)觀察核心巖藻糖基化修飾對(duì)β-catenin蛋白的影響。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1)Western-blot和HPLC結(jié)果顯示，在HEK293T細(xì)胞中，Wnt/β-catenin信號(hào)途徑激活時(shí)，F(xiàn)UT8

6、蛋白表達(dá)水平增高，催化活性增強(qiáng);
　　2)Western-blot結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)外源性FUT8后，HEK293T細(xì)胞內(nèi)Wnt/β-catenin信號(hào)途徑主要分子β-catenin、Wnt3a、Dvl2蛋白含量增加，該通路靶基因表達(dá)上調(diào);細(xì)胞免疫熒光化學(xué)、熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)外源性FUT8促使β-catenin蛋白定位于細(xì)胞核，激活信號(hào)通路;同時(shí)，平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)FUT8可以增強(qiáng)HEK293T細(xì)胞活力，

7、促進(jìn)細(xì)胞增殖;
　　3)Western-blot結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)FUT8能夠提高HEK293T細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白穩(wěn)定性，降低細(xì)胞內(nèi)蛋白泛素化修飾水平;免疫共沉淀及Lectin-blot結(jié)果顯示，β-catenin或該通路其他分子可能作為FUT8靶蛋白發(fā)生核心巖藻糖基化修飾。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論:
　　在HEK293T細(xì)胞中，激活Wnt/β-catenin信號(hào)途徑可以上調(diào)FUT8蛋白表達(dá)水平和催化活性。過(guò)表達(dá)核心巖藻