RhoA-Rho激酶與TGF-β1-CTGF通路在2型糖尿病大鼠肝臟纖維化中的作用.pdf

1、目的:糖尿病可以引起多種慢性并發(fā)癥，糖尿病肝臟損傷，尤其肝纖維化己日益受到學(xué)者們的關(guān)注。目前糖尿病致肝纖維化的發(fā)生機(jī)制尚不十分清楚，尚未找到阻止肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的有效藥物。本研究的目的就是要闡明RhoA/Rho激酶(ROCK)通路在糖尿病肝纖維化中的作用以及與TGF-β1/CTGF通路的調(diào)控關(guān)系，探討糖尿病肝纖維化發(fā)生的可能機(jī)制，以期為糖尿病肝纖維化的防治提供新的靶點(diǎn)。
　　 方法:通過(guò)高脂飲食結(jié)合小劑量鏈脲佐菌素(STZ，3

2、0mg/kg，i.p.)一次性腹腔注射建立2型糖尿病大鼠模型，同時(shí)設(shè)立正常對(duì)照組。10w末，行高胰島素正常葡萄糖鉗夾試驗(yàn)，測(cè)定葡萄糖輸注率(GIR);經(jīng)腹主靜脈取血檢測(cè)空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)、甘油三酯(TG)和膽固醇(TC)。后將糖尿病大鼠隨機(jī)分為糖尿病組和法舒地爾干預(yù)組(10mg/kg/d，i.p.2/d)，每周測(cè)定血糖和體重。24w末，腹主靜脈取血測(cè)FBG、FINS、TG、TC、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(

3、ALT)和糖化血紅蛋白(HbA1c)。分別留取肝臟組織供HE染色觀察肝臟組織形態(tài);Masson染色和羥脯氨酸(HYP)含量測(cè)定評(píng)估肝臟組織膠原沉積情況和含量;逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR)測(cè)定轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1mRNA、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子CTGFmRNA表達(dá)水平;免疫組織化學(xué)方法測(cè)定TGF-β1蛋白水平;Westernblot法測(cè)定肝臟磷酸化肌球蛋白磷酸酯酶靶點(diǎn)亞單位1(p-MYPT1)蛋白水平，代表ROCK活性。
　　

4、 結(jié)果:
　　 1、一般情況
　　 對(duì)照組大鼠飲水、進(jìn)食、活動(dòng)正常，皮毛順滑、光澤發(fā)亮。而糖尿病大鼠則出現(xiàn)明顯的多尿、多飲、多食、活動(dòng)明顯減少，毛色晦暗、雜亂，反應(yīng)遲鈍。
　　 2、體重的變化
　　 10w末，糖尿病大鼠體重顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。24w末，糖尿病組和法舒地爾干預(yù)組大鼠體重較對(duì)照組顯著下降(P＜0.05)，糖尿病組和法舒地爾治療組大鼠比較，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

5、r>　　 3、胰島素的敏感性
　　 10w末，糖尿病大鼠GIR與對(duì)照組相比顯著降低(5.32±0.83mg/kg.min比11.35±0.79mg/kg.min，P＜0.01)。24w末用FBG和FINS計(jì)算這三組大鼠的胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR=FBG×FINS÷22.5)。糖尿病組和法舒地爾干預(yù)組大鼠的HOMA-IR顯著高于對(duì)照組（117.9021.20和107.36±21.20分別比15.51±3.65，P＜0.01

6、）;糖尿病組和法舒地爾干預(yù)組大鼠的HOMA-IR無(wú)差異性(117.90±21.20比107.36±21.20，P＞0.05)。
　　 4、血生化指標(biāo)
　　 10w末，與同期對(duì)照組大鼠相比，糖尿病大鼠的FBG、FINS、TG和TC顯著增高(P＜0.01，P＜0.05)。24w末，糖尿病組大鼠FBG、FINS、HbA1c、TG、TC、ALT及AST均顯著高于同期對(duì)照組大鼠(P＜0.01);法舒地爾干預(yù)組大鼠ALT和AST較糖

7、尿病組大鼠顯著降低(P＜0.01）;但其FBG、FINS、TG、TC、HbA1c與糖尿病組大鼠比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 5、HE染色結(jié)果
　　 對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞排列整齊，中央靜脈周圍呈放射狀分布。肝細(xì)胞大小、形態(tài)正常，核結(jié)構(gòu)清晰。糖尿病組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝索排列紊亂，肝血竇擴(kuò)張，肝細(xì)胞明顯腫脹，脂肪變性，胞質(zhì)內(nèi)可見大小不等的球形脂滴，呈空泡狀，伴有炎細(xì)胞的浸潤(rùn)，在中央靜脈周圍可見

8、纖維組織增生。法舒地爾干預(yù)組大鼠上述改變均較糖尿病組大鼠明顯減輕。
　　 6、Masson染色結(jié)果
　　 正常對(duì)照組大鼠血管周圍可見少量被染成綠色的膠原纖維，(膠原面密度為:0.051±0.008)。與對(duì)照組相比，糖尿病組大鼠中央靜脈周圍可見大量膠原沉積(膠原面密度:0.083±0.109比0.051±0.008，P＜0.01)。法舒地爾干預(yù)組較糖尿病組大鼠肝膠原沉積顯著減少（膠原面密度:0.059±0.009比0.08

9、3±0.109，P＜0.01），與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(膠原面密度:0.059±0.009比0.051±0.008，P＞0.05)。
　　 7、肝臟膠原含量
　　 糖尿病組大鼠的肝臟膠原含量顯著高于對(duì)照組大鼠（268.79±10.85μg/g比164.89±10.15μg/g，P＜0.01）。法舒地爾干預(yù)組大鼠的肝臟膠原含量顯著低于糖尿病組大鼠(168.47±9.63μg/g比268.79±10.85μg/g，P

10、＜0.01)，與對(duì)照組大鼠比較，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（168.47±9.63μg/g比164.89±10.15μg/g,P＞0.05）。
　　 8、免疫組化染色結(jié)果
　　 對(duì)照組大鼠肝組織中TGF-β1呈弱陽(yáng)性表達(dá)(陽(yáng)性面積:0.169±0.100)。與對(duì)照組相比較，糖尿病組大鼠肝組織中TGF-β1廣泛表達(dá)，呈棕黃色顆粒，著色較深（陽(yáng)性面積:0.231±0.104比0.169±0.100，P＜0.01）。法舒地爾干預(yù)組大鼠

11、肝組織中TGF-β1表達(dá)較糖尿病組大鼠明顯減少（陽(yáng)性面積:0.178±0.08比0.231±0.104，P＜0.01），與對(duì)照組大鼠比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（陽(yáng)性面積:0.178±0.08比0.169±0.100，P＞0.05）。
　　 9、基因表達(dá)結(jié)果
　　 與對(duì)照組大鼠比較，糖尿病組大鼠肝組織TGF-β1mRNA、CTGFmRNA表達(dá)均顯著上調(diào)(P＜0.01）。法舒地爾干預(yù)組大鼠肝組織TGF-β1mRNA、CTGFmR

12、NA表達(dá)較糖尿病組大鼠顯著降低(P＜0.01），與對(duì)照組大鼠比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05）。
　　 10、ROCK活性的測(cè)定
　　 與對(duì)照組大鼠比較，糖尿病組大鼠肝組織p-MYPT1水平顯著增加(P＜0.01)。法舒地爾干預(yù)組大鼠肝組織p-MYPT1水平較糖尿病組大鼠顯著減少(P＜0.01），與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 結(jié)論:高脂飲食聯(lián)合小劑量STZ一次性腹腔注射能夠成功建立2