PVS-CP基因轉(zhuǎn)化馬鈴薯的研究.pdf

1、本研究以魯引1號(hào)、夏波蒂、早大白、大西洋4個(gè)品種的微型薯為材料，建立了離體再生體系和轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系，并用PVS-CP基因轉(zhuǎn)化馬鈴薯4個(gè)品種，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。 用脫毒微型薯獲得的試管苗在2MS液體培養(yǎng)基上經(jīng)20天培養(yǎng)即可獲得健壯的植株。選取健壯的試管苗在MS+8％蔗糖與MS大量元素+微量元素+肌醇+3mg/L6-BA的2種培養(yǎng)基上，經(jīng)暗培養(yǎng)可以結(jié)出試管薯，為通過試管薯途徑保存與交流轉(zhuǎn)基因材料提供了方便。 實(shí)驗(yàn)表明，魯引1

2、號(hào)、夏波蒂葉盤外植體在MS+0.5mg/LNAA+4mg/L6-BA培養(yǎng)基上可誘導(dǎo)出鮮綠色顆粒狀、結(jié)構(gòu)緊密的愈傷，愈傷在MS+5mg/L6-BA+1mg/LZT培養(yǎng)基上可分化出不定芽，分化率分別為86.7％和93.3％。個(gè)品種的微型薯切塊在MS+2mg/LIAA+1mg/L6-BA+4mg/LZT+6mg/LKT的培養(yǎng)基上都可直接誘導(dǎo)出不定芽，魯引1號(hào)的誘導(dǎo)率為63.3％，其他3個(gè)品種的誘導(dǎo)率均在90.0％以上。在MS培養(yǎng)基上可順利生根

3、，形成完整的植株。 用PVS-CP基因的上、下游引物及質(zhì)粒pGEM-pvs為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳顯示擴(kuò)增產(chǎn)物為約900bp的特異條帶。用Ultrafree-DA試劑盒一步離心法回收特異擴(kuò)增條帶并與pGEM-TEasy載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化受體菌DH5α獲得氨芐青霉素抗性菌落，經(jīng)PCR及單、雙酶切鑒定，篩選出了陽性克隆，其重組質(zhì)粒命名為pGEM-pvsk。 pGEM-pvsk經(jīng)KpnⅠ與BglⅡ雙酶切后回收目

4、的基因片段，植物表達(dá)載體pCambia-2300-35S-OCS經(jīng)KpnⅠ與BamHⅠ雙酶切后回收9Kb的片段。2個(gè)回收后的DNA片段連接后轉(zhuǎn)化受體菌DH5α，經(jīng)卡那霉素抗性篩選、質(zhì)粒電泳檢測(cè)、PCR擴(kuò)增及XbaⅠ的單酶切鑒定，篩選出了陽性克隆，其重組質(zhì)粒命名為pCambia2300-pvsk。結(jié)果表明PVS-CP基因已定向插入到植物表達(dá)載體上，即獲得了預(yù)期的PVS-CP基因的植物表達(dá)載體。該表達(dá)載體中PVS-CP基因受CaMV35S啟

5、動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)，基因的3，末端是OCS終止子，在該質(zhì)粒的T-DNA區(qū)除了PVS-CP基因外，還有NPTⅡ基因。 pCambia2300-pvsk轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，經(jīng)卡那霉素與利福平抗性篩選、PCR擴(kuò)增及XbaⅠ單酶切鑒定，獲得了預(yù)期的轉(zhuǎn)化子EHA105(pCambia2300-pvsk)。 用農(nóng)桿菌EHA105(pCambia2300-pvsk)侵染馬鈴薯的葉盤和薯塊外植體，經(jīng)卡那霉素抗性篩選獲得了抗性不定芽及植株。4